应用microRNA微阵列技术研究乳腺癌microRNA的差异表达谱

摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近年来，乳腺癌发病率不断上升，严重危害女性健康。然而乳腺癌发生发展的分子机制至今仍不清楚，进一步探索乳腺癌的分子发生机制对提高乳腺癌诊断与治疗水平有重要意义。 miRNA(MicroRNA)是一类长约19-25nt的单链非编码RNA，广泛存在于动、植物中，具有物种及组织特异性，进化上高度保守。miRNA可与其靶mRNA的3’非翻译区(3’untranslatedregions，3’-UTRs)特异性结合，引起靶mRNA的翻译抑制或降解，在细胞的生长、分化及死亡过程中发挥重要作用。MiRNA的异常表达与肿瘤的发生相关，可能起到癌基因或抑癌基因的作用。 本研究拟采用miRNA微阵列技术筛选乳腺癌组织差异表达的miRNAs，并探讨其与乳腺癌发生发展的关系，以期为阐明miRNA在乳腺癌发生发展的分子机制中的作用提供新的依据。 材料和方法： 收集2005年11月至2006年3月在中山大学肿瘤防治中心手术切除的8例乳腺癌新鲜标本，病理组织学确诊为乳腺浸润性导管癌；分别取癌旁组织(距癌组织大于2cm)及癌组织，Trizol法抽提总RNA后，用Ambion’SmiRNAIsolationKit分离出miRNA；将Cy3y荧光标记的miRNA进行miRNA微阵列芯片杂交反应；采集芯片原始信号值并将图像信号转化为数字信号，对每个miRNA的信号值取均值，导入Cluster3.0进行聚类分析；应用实时定量RT-PCR方法验证miRNA芯片结果的可靠性。 结果： 聚类结果显示，相对于癌旁组织，乳腺癌组织中miR-21、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-365、miR-155、miR-98、let-7g表达上调，miR-320、miR-497、miR-422b、miR-361、miR-191、miR-17-3p表达下调。 挑选miR-21、miR-125b、miR-137、miR-145、miR-376a和miR-497在标本60T和1P(60T和1P是配对的癌及癌旁组织)进行定量RT-PCR验证，同时进行U6扩增作为内参。在样本60T和1P中的CP值分别为：U6(15.0；15.8)，miR-21(13.4；14.7)，miR-125b(17.6；16.2)，miR-137(31.9；29.2)，miR-145(20.2；18.7)，miR-376a(22.6；21.4)，miR-497(24.3；22.1)。融解曲线显示单峰，定量RT-PCR产物凝胶电泳显示单一特异性条带，表明具有良好扩增特异性。将定量RT-PCR和miRNA芯片结果进行归一化处理后显示定量RT-PCR与miRNA芯片结果一致性较好。 结论： 1.乳腺癌组织中miR-21、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-365、miR-155、miR-98、let-7g表达上调，miR-320、miR-497、miR-422b、miR-361、miR-191、miR-17-3p表达下调；提示上述miRNAs的表达异常可能与乳腺癌的发生发展相关。 2.靶点预测显示，乳腺癌中差异表达的miRNAs作用靶点非常广泛，涉及到癌基因、抑癌基因、信号转导通路基因等。提示上述miRNAs的表达失调可能导致其靶基因表达异常，进而在乳腺癌的发生发展中起到重要作用。 3.实时定量RT-PCR与miRNA芯片结果一致，表明miRNA芯片结果真实可靠，并且定量RT-PCR也是一种快速有效检测miRNA表达的方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第1章 引 言

1.miRNA

2.乳腺癌

第2章材料与方法

1.材料

2.方法

第3章 结 果

1.miRNA微阵列芯片结果

2.定量RT-PCR结果

3.定量PCR与miRNA芯片结果比较

第4章 讨 论

1.miRNA在肿瘤中的研究

2.miRNA的靶点预测

3.检测miRNA表达的方法

第5章结 论

参考文献

附 图

致谢