带胍基侧臂的2，2’-联吡啶基铜、锌配合物对金属核酸酶的模拟

摘要

胍基化合物及其衍生物作为精氨酸残基的一部分，在具有生物活性的肽和蛋白质中起着非常重要作用。胍基上的氮原子和氢原子多，且在生理pH介质中就能完全质子化，形成带正电荷的基团，因此容易通过氢键或静电作用在配基与受体或酶与底物之间形成特殊的相互作用，特别是对磷酸酯、羧酸酯等有高度的亲和性。由于胍类化合物具有良好的催化、分子识别及配位能力，因此在生物学上有非常广泛的用途，特别是在合成模拟酶方面。本论文在我们课题组前期研究的基础上，通过修饰2,2'-联吡啶和1,10-邻菲咯啉的侧臂，设计合成了一系列含胍基功能团的Cu(II)、Zn(II)金属核酸酶模型配合物，对酶的金属中心及其周围的部分功能氨基酸残基进行模拟。主要的研究结果概括如下： 1.本部分工作主要对间位修饰的联吡啶铜配合物1、2和Cu(bpy)Cl2的金属酶活性进行了研究。用pH电位滴定表征了配合物2在溶液中的物种分布；热变性实验结果显示这些配合物对CT-DNA具有较强的亲和力；在未加入任何还原剂条件下，断裂pBR322DNA研究显示配合物2和1的核酸酶活性均比未进行任何修饰的简单类似物[Cu(bpy)Cl2]2+高，其饱和动力学常数(Kcat和KM)分别为4.42h-1和7.46×10-5M(2)，以及4.21b-1和1.07×10-4M(1)，说明带正电荷的基团有利于催化DNA的断裂；自由基淬灭实验和T4连接酶实验证明配合物2是通过水解机理断裂DNA。配合物2的高活性可归因于，其活性中心与两个侧臂带正电荷基团之间的距离与DNA链上的磷酸酯骨架相匹配，两端胍基与中心Cu-OH活性部分对核酸中不同磷酸酯的协同作用加速了DNA断裂。通过黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-NBT法测定了模拟物的SOD活性，结果显示，胍基修饰侧臂的铜配合物具有相对高自的SOD活性。高活性主要归因于带正电荷的胍基功能团，主要起到以下几个作用：(1)对Cu(II)的电荷补偿作用，使得其氧化还原电势提高；(2)能够通过静电作用吸引O2-使其富集在活性中心周围。 2.本部分工作主要邻位修饰胍基功能团的联吡啶铜配合物3进行核酸酶活性研究。通过与第三章的Cu(II)配合物2及其Cu(bpy)Cl2进行对比，进一步考察功能基团的位置、位阻效应等因素对配合物的金属酶活性的影响。考察了配合物对DNA模型物BNPP的磷酸酯水解效果，配合物3和2催化BNPP水解的二级速率常数kcat分别是8.91×10-5和5.73×10-5，与未经修饰的简单对照物Cu(bpy)Cl2相比，它们的反应速率分别提高了将近360和230倍。通过CD光谱和热变性实验研究了这些配合物与CT-DNA的作用力，结果表明这些配合物与CT-DNA之间的作用大小为次序为：2>3>Cu(bpy)Cl2。研究了配合物对DNA的氧化断裂作用，发现在还原剂的存在下，配合物3、2能在低浓度短时间内有效断裂DNA，动力学参数表明它们的DNA切割活性大小为2>3>Cu(bpy)Cl2，与作用力大小顺序基本一致。通过自由基淬灭实验，研究了DNA的氧化断裂机理，结果表明HO-、H2O2和1O2均参与了对DNA的切割，其中H2O2是主要的活性氧物种。通过内切酶抑制实验，研究了配合物跟DNA结合的序列选择性，实验结果表明配合物3、2能选择性的与富含A、T的碱基序列结合。 3.为了更好地模拟天然核酸酶活性中心的Zn(II)离子，对邻、间位修饰胍基功能团的2,2'-联吡啶的锌配合物进行金属酶活性研究。研究了该系列的配合物的磷酸二酯水解活性，考察功能基团的位置、位阻效应等因素对配合物的金属酶活性的影响，动力学研究结果表明带正电荷胍基基团的配合物有利于催化BNPP的断裂，其催化速率常数比配合物[Zn(bpy)CL2]2+要高300-600倍。而且发现BNPP水解活性跟胍基功能团与金属活性中心的位置有关，即距离越近，活性越高，近距离的胍基上能与底物形成更多更牢的氢键作用，使底物更稳定的固定在活性中。通过紫外滴定和CD光谱研究了这些配合物与CT-DNA的作用力，结果表明这些配合物与CT-DNA之间的作用大小为次序为：4>5>Zn(bpy)Cl2。并通过它们对pBR322DNA切割作用来研究其核酸酶活性，活性大小为4>5>Znq(bpy)Cl2，与作用力大小顺序基本一致。通过内切酶抑制实验，研究配合物跟DNA结合的序列选择性，实验结果表明配合物4、5能选择性的与富含A、T的碱基序列结合。 4.对2,9-二甲基-1,10-菲咯啉的甲基进行修饰，引入胍基功能团，设计合成了含胍基的菲咯啉衍生物(L4)，及其铜配合物[Cu(L4)Cl2](ClO4)2-4H2O-CH3OH(6)和锌配合物[Zn(L4)Cl2](ClO4)2·2H2O(7)。研究了铜配合物6对DNA的氧化断裂作用，发现在还原剂的存在下，能在低浓度短时间内有效断裂DNA；通过自由基淬灭实验，研究了DNA的氧化断裂机理，结果表明HO-、H2O2和1O2均参与了对DNA的切割，其中H2O2是主要的活性氧物种，通过Fenton机理产生的活性氧物种来断裂DNA。锌配合物7在少量过氧化氢存在下，也能非常有效的切割DNA。内切酶抑制实验研究表明，配合物6和7都选择性的与富含A、T的碱基序列结合。这两个配合物的BNPP水解效果，与邻位的联吡啶配合物在数量级上均相差不大，说明胍基修饰的菲咯啉和联吡啶在结构上比较类似。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章前言

1.1 研究背景

1.2 酶结构中胍基的作用

1.3 含有胍基的天然产物

1.4 胍类化合物的分子生物学研究

1.4.1 对磷酸酯键的识别及断裂

1.4.2 对DNA分子序列性的识别促进DNA断裂

1.4.3 含胍基功能团的超分子化合物

1.5 胍类化合物在药物设计中的应用

1.6 本文设计思路和主要工作

参考文献

第2章 配体及配合物的合成与表征

2.1 试剂和仪器

2.1.1 试剂

2.1.2 仪器

2.2 配体的合成

2.2.1 配体L1和L2的合成

2.2.2 配体L3的合成

2.2.3 配体L4的合成

2.3 配合物的合成

2.3.1 配合物2([Cu(L2)Cl2](ClO4)2·H2O)的合成

2.3.2 配合物1([Cu(L1)Cl2](ClO4)2)的合成

2.3.3 配合物3([Cu(L3)Cl2](ClO4)2·2H2O)的合成

2.3.4 配合物4([Zn(L2)Cl2](ClO4)2·4H2O·CH3OH)的合成

2.3.5 配合物5([Zn(L3)Cl2](ClO4)2·H2O)的合成

2.3.6 配合物6([Cu(L4)Cl2](ClO4)2·4H2O·CH3OH)的合成

2.3.7 配合物7([Zn(L4)Cl2](ClO4)2·2H2O)的合成

参考文献

第3章间位修饰胍基功能团的2,2'-联吡啶铜配合物对金属核酸酶的模拟

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 实验试剂和仪器

3.2.2 晶体结构的测定

3.2.3 电位滴定

3.2.4 配合物催化磷酸酯水解的动力学研究

3.2.5 CT DNA热变性曲线的测定及△Tm值的计算

3.2.6 DNA切割实验

3.2.7 配合物断裂DNA的动力学研究

3.2.8 配合物2的T4连接酶实验

3.2.9配合物的SOD活性测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 配合物2的晶体结构描述

3.3.2 电位滴定测定配合物在溶液中的物种分布

3.3.3 配合物催化BNPP水解动力学研究

3.3.4 配合物对DNA的亲和力研究

3.3.5 无氧化还原剂存在下配合物对DNA的断裂研究

3.3.6 配合物断裂DNA的动力学研究

3.3.7 配合物水解断裂DNA的机理探讨

3.3.8 配合物SOD活性的研究

3.4 小结

参考文献

第4章邻位修饰胍基功能团的2,2'-联吡啶铜配合物对金属核酸酶的模拟

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 药品和仪器

4.2.2 配合物催化磷酸酯水解的动力学研究

4.2.3 CD光谱测定

4.2.4 CT DNA热变性曲线的测定及△Tm值的计算

4.2.5 DNA切割实验

4.2.6 自由基淬灭实验

4.2.7 配合物与DNA特异性结合研究

4.3 结果与讨论

4.3.1 配合物催化BNPP水解动力学研究

4.3.2 配合物与CT-DNA相互作用的研究

4.3.3 配合物催化断裂DNA的研究

4.3.4 配合物断裂DNA的机制研究

4.3.5 配合物与DNA特异性结合的研究

4.4 小结

参考文献

第5章侧臂修饰胍基功能团的2'2'-联吡啶锌配合物对金属酶的模拟

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 药品和仪器

5.2.2 配合物催磷酸酯水解的动力学研究

5.2.3 CD光谱测定

5.2.4 紫外光谱滴定

5.2.5 DNA切割实验

5.2.6 DNA配合物与DNA特异性结合的研究

5.3 结果与讨论

5.3.1 配合物催化BNPP水解动力学研究

5.3.2 配合物与CT－DNA相互作用的研究

5.3.3 配合物催化断裂DNA的研究

5.3.4 配合物与DNA特异性结合的研究

5.4 小结

参考文献

第6章胍基修饰的双侧臂邻菲咯啉铜、锌配合物对金属核酸酶的模拟

6.1 引言

6.2 实验部分

6.2.1 药品和仪器

6.2.2 DNA切割实验

6.2.3 DNA配合物与DNA特异性结合的研究

6.2.4 配合物催化BNPP水解的动力学研究

6.3 结果与讨论

6.3.1 Cu(Ⅱ)配合物催化断裂DNA的研究

6.3.2 Cu(Ⅱ)配合物催化断裂DNA的机制研究

6.3.3 Zn(Ⅱ)配合物催化断裂DNA的研究

6.3.4 配合物与DNA特异性结合的研究

6.3.5 配合物催化BNPP水解动力学研究

6.4 小结

参考文献

第7章总结与展望

7.1 总结

7.2 不足与展望

附录

致谢