海水养殖环境蛭弧菌类生物多样性及噬菌弧菌DA5对细菌的生物控制

摘要

蛭弧菌类生物(Bdellovibrio—and—like organisms，BALOs)，是一类以裂解其它革兰氏阴性菌为生的小型寄生性细菌，普遍存在于自然和人工生境中，对环境细菌的群体结构和动力学可能具有重要影响，在有害细菌的生物控制上具有潜在应用价值。 本论文首先通过分离培养结合分子分型和系统鉴定，对广东省湛江市海水养殖较集中的东海岛和南三岛虾池及其近岸海水BALOs进行了较系统调查。结果显示以溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)zouA(zouA)为宿主菌，双层平板计数虾池及其近岸表层海水BALOs含量为47-1238 pfu/mL，且BALOs含量与异养细菌含量呈正相关。本研究首次将PCR—变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)用于二元培养状态下BALOs的直接分型，并通过靶向16S rDNA V3区PCR—DGGE和噬菌弧菌科(Bacteriovoracaceae)特异的16S rDNA扩增核糖体DNA限制性分析(amplified rDNA restriction analysis，ARDRA)将130株BALOs分离物分别区分为五种和四种种系型(phylotype)。系统分析表明本研究所有BALOs分离物均属于噬菌弧菌科噬菌弧菌属(Bacteriovorax)，但包含在四个不同的类群(cluster)(Ⅳ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ)，且两种分型方法给出的结果在类群水平上完全一致。类群Ⅸ菌株在所有水样中都有分离到，并且是130株分离物中的最优势类型(40.8％)；类群Ⅹ菌株除在虾池NF样品中未检测到外，也普遍存在于各水样中；类群Ⅳ菌株则从所有盐度相对较低(<25‰)的水样中被优势分离；而类群Ⅵ的两个分离物仅从一个赫度最低(8.26‰)的虾池中获得。 对上述四个类群12株代表性BALOs菌株的生长温度和盐度以及对六种常见对虾病原弧菌的裂解能力进行了研究，并通过透射电子显微镜分析了其中四个代表菌株的形态特征。结果表明，同一类群或亚群内菌株的生长温度或盐度范围相同，即类群Ⅳ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ菌株的生长温度范围分别为20℃—35℃、15℃—35℃、15℃—40℃、10℃—40℃，最适生长温度都约为30℃或35℃；生长盐度范围分别为5‰—40‰、2.5‰—30‰、5‰—60‰和5‰—60‰，最适生长盐度分别约为10‰、5‰、20‰和20‰。被测的六种弧菌中有三种可被全部12株BALOs裂解，而其它弧菌仅被部分BALOs裂解，但即使同一类群菌株，对某些弧菌也表现不同的裂解能力。形态上，四株不同类群BALOs均呈典型的弧状细胞，具极生单鞭毛。 首次通过不依赖培养的分子生态学技术对海水养殖环境BALOs多样性进行了研究。采用特异16S rRNA基因引物分别构建了湛江市邻近东海堤四个虾池表层水样噬菌弧菌和吞菌弧菌(Peredibacter)16S rRNA基因文库，并结合ARDRA分型和测序，分析了两大类型BALOs的系统发育。结果表明海水虾池中普遍存在高度多样的噬菌弧菌和吞菌弧菌。以16S rRNA基因序列相似性97％作为界定BALOs类群或潜在“种”的标准，本研究四个噬菌弧菌总文库共包括33个类群，其中27个为首次报道的新类群；仅有四个类群(Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ)属于已知可培养噬菌弧菌类群，但它们的克隆数则占总文库的一半，且类群Ⅸ和Ⅺ克隆分别为最优势(占36.7％)和第二优势(占9.9％)类群。除了一个含有可培养吞菌弧菌的类群(P.starrii A3.12)外，本研究吞菌弧菌总文库15个类群中的14个为首次报道的新类群。系统分析显示噬菌弧菌和吞菌弧菌彼此互为最紧邻的分支，并作为一个整体与蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)亲缘关系最近，而与δ—变形细菌(δ—proteobacteria)中其它科相距较远，但两者间的序列差异也大于10％。同一水样噬菌弧菌和吞菌弧菌间种群多样性可能表现一定程度的竞争或排斥，但四个水样间总的BALOs多样性大小较一致。 为了解海洋BALOs对海水养殖环境细菌的生物控制效果及其影响因素，选择噬菌弧菌菌株DA5为代表分别研究了DA5对海水中单一宿主菌zouA的裂解作用，对添加营养的自然海水中细菌含量和几种水体理化指标的影响，以及DA5对zouA感染凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼体的试验性治疗效果。结果表明，DA5对海水中zouA的最适裂解温度和盐度范围分别为30℃—35℃和20‰—30‰，提高通气或初始感染复数有利于DA5快速裂解zouA。适宜条件下，DA5在较短时间(12 h)内可降低海水中zouA含量两个数量级，但较长时间(15 d)也不能完全清除宿主细胞；DA5对自然海水中异养细菌和弧菌均有一定的清除作用，且对弧菌的消减效果更明显，但对水体pH、化学需氧量(COD)、氨氮(NH3-N)和亚硝酸氮(NO2-N)含量均无显著影响；以不同浓度DA5攻击期细胞处理时，较高含量的DA5可减少或显著减少对虾幼体感染zouA的死亡率。 为评估DA5在无明显病害出现情况下对对虾育苗水体细菌群落结构的影响和对细菌性病害可能的预防作用，研究了DA5以两种不同浓度(初始水体含量4550和455 pfu/mL)加入凡纳滨对虾育苗水体后，对溞状幼体期间水体细菌含量和种群结构的影响，对幼体存活率的影响以及对水体理化指标的影响。平板计数结果显示高浓度DA5较短时间内(12h)对育苗水体异养细菌和弧菌含量均具有较明显消减作用，但DGGE分析表明本研究条件下DA5对水体优势细菌种群结构影响不明显，可能仅对极少数非优势细菌种群结构具有调控作用；高含量DA5一定程度上具有促进幼体存活的作用，而低浓度DA5则无明显作用。试验期间DA5处理组和对照组间水体pH、COD、溶解氧、NH3-N和NO2-N含量均无显著差异。 本研究最后采用经典培养法结合PCR基础的分子检测，首次系统报道了商品化BALOs制剂的质量。结果表明被检测的八个水产养殖用BALOs制剂中有六个质量明显不合格，仅两个样品被蛭弧菌科特异引物检测为阳性，被双层平板证实有噬斑出现。其中一个样品中存在两种形态和宿主范围不同的噬斑分离物，且不同宿主菌计数结果存在明显差异。16S rRNA基因序列分析表明这两种噬斑分离物分别属于蛭弧菌科类群1即噬菌蛭弧菌(B．bacteriovorus)和未定种的类群5。但另一样品的噬斑分离物则被证实为非BALOs。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章前言

1.1 BALOs的发现和概念

1.2 BALOs分类和系统多样性

1.3 BALOs形态和生活史

1.4 BALOs的生态学及其研究方法

1.4.1生态分布

1.4.2研究方法

1.5 BALOs应用研究

1.6本论文研究目的和意义

第二章海水养殖环境BALOs的分离、鉴定和特征

2.1材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.2实验结果与分析

2.2.1 BALOs的分离和计数

2.2.2基因组DNA的提取

2.2.3 PCR-DGGE分型

2.2.4 ARDRA分型

2.2.5代表性分离物16S rRNA基因的克隆和转化

2.2.6基于16S rDNA的系统进化分析

2.2.7代表性分离物的生长温度范围

2.2.8代表性分离物的生长盐度范围

2.2.9代表性分离物对对虾病原弧菌的裂解能力

2.2.10代表性分离物的形态特征

2.3讨论

2.3.1 M／H BALOs分离培养基和宿主菌的选择

2.3.2 BALOs分离物的分型方法

2.3.3海水养殖环境BALOs的含量

2.3.4可培养M／H BALOs的系统多样性

2.3.5 M／H BALOs的生长特性

2.3.6海水养殖生物防治用M／H BALOs的选择

第三章不依赖培养的虾池海水BALOs多样性研究

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.2实验结果与分析

3.2.1水样总DNA的提取

3.2.2 BALOs特异引物的PCR扩增

3.2.3基于噬菌弧菌16S rDNA文库的多样性分析

3.2.4基于噬菌弧菌16s rDNA文库的系统发育分析

3.2.5基于吞菌弧菌16S rDNA文库的多样性分析

3.2.6基于吞菌弧菌16S rDNA文库的系统发育分析

3.2.7 BALOs克隆文库间的相似性分析

3.3讨论

3.3.1不依赖培养的分子生态学技术及其在BALOs研究中的应用

3.3.2 M／H BALOs的系统多样性

3.3.3虾池海水中的优势BALOs类群

3.3.4海水养殖环境BALOs多样性的意义

第四章噬菌弧菌DA5对海水细菌的生物控制

4.1材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验方法

4.2实验结果与分析

4.2.1温度、盐度、通气和感染复数对DA5裂解zouA的影响

4.2.2 DA5与zouA在海水中相互作用时的数量变化

4.2.3 DA5对养殖区海水异养细菌、弧菌和BALOs数量的影响

4.2.4 DA5对水体pH、COD、NH3-N和NO2-N含量影响

4.2.5 DA5对对虾幼体感染zouA的防治

4.3讨论

4.3.1 M／H BALOs对单一宿主菌的裂解作用

4.3.2 BALOs对混合菌群的裂解作用

4.3.3 BALOs对养殖水体理化指标的影响

4.3.4 M／H BALOs对弧菌病的防治

第五章噬菌弧菌DA5对对虾育苗水体细菌群落结构的影响

5.1材料与方法

5.1.1实验材料

5.1.2实验方法

5.2实验结果与分析

5.2.1 DA5对育苗水体细菌含量的影响

5.2.2水样总DNA的提取和V3区PCR扩增

5.2.2 DGGE评估DA5对育苗水体细菌群落结构的影响

5.2.3 DA5对育苗水体水质理化指标的影响

5.2.4 DA5对对虾幼体存活的影响

5.3讨论

5.3.1 M／H BALOs在对虾育苗中应用的可能性

5.3.2 DA5对对虾育苗期水体菌群的调控

5.3.3 DA5对对虾幼体存活的影响

5.3.4 M／H BALOs在海水养殖中的应用方式

第六章几种水产养殖用BALOs制剂的检测

6.1材料与方法

6.1.1实验材料

6.1.2实验方法

6.2实验结果与分析

6.2.1样品理化指标和异养细菌含量

6.2.2优势异养细菌的分离

6.2.3噬斑含量和宿主裂解范围检测

6.2.4 BALOs制剂及其噬斑分离物的总DNA提取

6.2.5 BALOs制剂及其噬斑分离物的分子检测

6.2.6 16S rDNA序列分析

6.3讨论

总结

参考文献

附录

攻读博士学位期间已发表和待发表的论文

致谢