果蝇miRNA的演化研究——miRNA的动态演化、保守性原因及功能假说

摘要

MiRNA是一类负责转录后调控的内源小分子RNA。在本研究中，我们首先研究了果蝇miRNA基因的演化过程。使用高通量测序技术，我们在三个不同物种的雄果蝇头部中分别获得了16436，86535和44395个小分子RNA表达标签。在这些小分子RNA中，总共有107100条序列标签可以被对应到miRNA基因的座位，其中至少有300个miRNA的基因座位是本研究首次发现的。通过研究这些miRNA的演化过程，我们提出miRNA基因和其它基因一样，也经历着“产生”和“消亡”的过程。另外，大量物种特异的miRNA表明，miRNA基因的“产生率”是相当高的，我们估计大概是每百万年产生12个miRNA。然而，由于这些新产生的miRNA在产生后会很快消失，只有不到4％能够被保存下来，并且在历经更长的演化之后，保存下来的miRNA中只有60％能够最终整合进物种的转录组。故miRNA的“净产生”（net gain）率只有每千万年产生3个新miRNA，是非常低的。进一步的研究表明，在果蝇中产生新miRNA的主要生化机制是“点突变”，非miRNA的序列将由一系列的点突变而形成新的miRNA。 对于果蝇中那些高度保守的miRNA，我们研究了可能导致其“骨架”（backbone）序列高度保守的原因。一个miRNA基因包括了“成熟 miRNA”（mature miRNA，用miR代表），而其它部分则是“骨架”序列。“骨架”的作用在miR加工合成中能形成特定的二级结构。我们分析了所有果蝇12个物种中miR都没有发生改变的miRNA，辅以计算机模拟，发现二级结构不足以提供足够的约束力来导致“骨架序列”具有较低的演化速率。为此我们检验了其它的可能约束力。特别的，我们假设对于具有相同二级结构的不同序列，其产生miR时的error rate可能不同。当miR加工时产生5’端不同的变体可能会对生物有不利的影响。通过比较三个果蝇物种miRNA的高通量测序结果，我们发现加工miR的error rate在高表达的miRNA基因中具有较高的保守性。面对于低表达的miRNA，其error rate则有演化的空间，暗示高error rate对于低表达的miRNA是可以容忍的。综合这些观察结果，我们提出miRNA的backbone的高度保守性是受到三维结构的约束，约束的原因在于特定的三维结构则能减小miR加工过程中的error rate。 最后，为了解释miRNA基因一方面高度保守，另一方面其功能又可有可无的特点，我们提出了“双重功能”（dual function）的假设来理解miRNA在调控中的这一非传统角色。miRNA可以被看做是候选的“canalization”基因。具体的，我们建立了一系列反应动力学模型来描述miRNA的靶基因在不同的调控网络中的行为。结果表明，1）Incoherent motif可以缓冲环境因素和“反式调控”效应所引起的噪音，然而这种缓冲效果不能增加遗传率（heritability）；2）不管是Incoherent motif还是Coherent motif都不能减小由于“顺式调控”效应引起的嗓音（发生在promoter或miRNA结合位点区域的遗传变异导致的噪音）；3）带有miRNA的Incoherent motif由于可以减少环境因素导致的变异，并同时还能增加遗传度，从而更具有演化性（evolvability）。故我们认为在某种情况下，miRNA的功能可以是“canalization”基因，以增加自然选择的效率。进一步的，由于这些新产生的miRNA由于其表达量较低，不太可能会直接调控基因表达的开关，反倒是这种能减弱噪音的特点提供了新产生的miRNA基因的选择优势。

目录

文摘

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声明

第一章引言

1.1生物系统的复杂性和“中心法则”

1.2复杂的基因调控机制

1.3 miRNA发现的历史和功能

1.4 miRNA同靶基因的相互作用

第二章“是生，还是死，这是个问题”——果蝇miRNA的动态演化

2.1前言

2.2材料和方法

2.2.1模式物种的选取和小分子RNA的来源

2.2.2文库构建和测序

2.2.3小分子RNA的初步分析和mapping

2.2.4 miRNA的预测和鉴别

2.2.5 miRNA的保守性估计

2.2.6 miRNA的演化分析

2.2.7 miRNA演化的数学模型

2.2.8 miRNA的表达量的比较

2.3实验结果

2.3.1小分子RNA reads的mapping和miRNA的预测

2.3.2 miRNA的演化分析结果

2.3.3 miRNA的生存函数和产生率的估计

2.3.4 miRNA的表达量和保守性的关系及物种间的表达差异

2.4讨论

2.4.1测序的深度和广度对miRNA的“净产生率”(net gain rate)估计的影响

2.4.2miRNA的生产机制

2.4.3miRNA物种间表达的差别

第三章“精益求精”——果蝇miRNA前体的保守性及其原因

3.1前言

3.2材料和方法

3.2.1果蝇已知miRNA的backbone的定义

3.2.2 miRNA保守性的分析

3.2.3基于不同约束条件的计算机模拟分析

3.2.4估算miRNA合成的error rate

3.2.5对高表达miRNA error rate精确性的统计检验

3.3实验结果

3.3.1 miRNA基因backbone的保守性

3.3.2 miRNA演化中的约束力——“热力学稳定性”和“二级结构”

3.3.3假设一：RNA折叠的鲁棒性导致约束

3.3.4假设二：miRNA合成的error rate的限制导致约束

3.4讨论

第四章“刚柔相济”——关于miRNA功能的假说

4.1前言

4.2方法和建模

4.2.1基因表达动力学模型的构建

4.2.2各类噪音的建模

4.2.3计算机模拟

4.3模拟的结果

4.3.1没有引入“遗传变异”噪音的情况

4.3.2引入了“遗传变异”噪音的情况

4.3.3不同motif的遗传率(heritability)的研究

结 语

参考文献

致谢

在读期间参与发表的论文