17-β雌二醇抑制脂多糖诱导的血管平滑肌细胞MCP-1表达和细胞迁移

摘要

动脉粥样硬化是一种慢性免疫炎症性疾病，从早期的内皮损伤激活到末期的血栓综合症形成均有炎性反应的参与。传统的动脉粥样硬化危险因素(吸烟、高血糖、高血压或血脂异常)以及机械损伤也能通过触发动脉壁炎症反应，加速动脉粥样硬化损伤的形成。细胞因子在炎症通路中处于核心地位，除免疫细胞之外，血管壁的主要组成成分内皮细胞、平滑肌细胞也能产生细胞因子，并受细胞因子调节，还能通过细胞因子介导，与入侵的单核细胞、T细胞、肥大细胞产生相互作用，引起免疫细胞的聚集增加，低密度脂蛋白和细胞外基质的沉积，引发动脉粥样硬化损伤，且作为一种“免疫血管记忆”，不断加剧这一动脉粥样硬化损伤过程。流行病学调查显示去除其他致动脉粥样硬化的危险因素的影响，单独的慢性炎症状态如呼吸道和泌尿道革兰氏阴性菌感染也会增加动脉粥样硬化的发生率。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌细胞壁中对热抵抗、并且只有当细菌崩解后才释放出来的非蛋白质成分，能强烈诱发炎症反应，即使健康人群的血清中也可检测到LPS的存在。流行病学调查显示血清中LPS浓度高于50pg/mL的受试者发生动脉粥样硬化的危险较低于平均水平(14.3pg/ml)者高3倍，动物实验也表明长期慢性低剂量注射LPS增大高脂血症家兔，载脂蛋白-E(apolipoprotein-E，apo-E)缺陷小鼠动脉粥样硬化损伤面积，提示LPS促进动脉粥样硬化的发生发展，LPS能促进粘附分子、白细胞介素、趋化因子等多种炎症因子的表达，这些炎症因子的表达能促进免疫细胞与血管壁细胞的相互作用，促进动脉粥样硬化损伤的进展。雌激素具有抗动脉粥样硬化的效应，其抗动脉粥样硬化的机制与多种因素有关，近年来的研究显示，其抗动脉粥样硬化的机制与抑制炎症反应，尤其是抑制炎症因子的表达有关。去势动物会处于轻微的炎症状态，补充雌激素治疗能改善这一状态，表现为包括MCP-1在内的一系列细胞因子表达的降低。绝经后妇女给与激素替代治疗也能降低MCP-1等众多炎症因子，提示雌激素可能通过抑制炎症反应，对抗动脉粥样硬化损伤。
　　 单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是趋化因子CC家族的成员，能吸引单核细胞向炎症部位聚集，通过吸引单核细胞转移至内皮下，转化为巨噬细胞吞噬脂质转变为泡沫细胞，形成并扩大动脉粥样硬化损伤，在始动和促进动脉粥样硬化的发展中有重要作用。对人群动脉粥样硬化源性的周围动脉疾病以及冠心病进行的病例对照研究显示，MCP-1的表达随动脉粥样硬化程度的增加而升高，是心血管疾病的独立危险因素。正常血管几乎检测不到MCP-1，在人和动物的动脉粥样斑块则出现高表达。ox-LDL、同型半胱氨酸等促进AS的介质都能刺激血管内皮细胞和平滑肌细胞MCP-1的生成，介导动脉粥样硬化的早期损伤并作用于动脉粥样硬化的始终。多项研究表明抑制MCP-1，能降低动脉粥样硬化损伤。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)是动脉中层的主要成分，其迁移和过度增殖以及由此引起的大量的细胞外基质合成是动脉粥样硬化、高血压和经皮腔内冠状动脉成形术后管腔狭窄等多种心血管疾病的形成过程中的关键环节，过程复杂，受多种因素的调节，炎症因素在其中起了重要的中介作用，免疫组织化学和原位杂交方法显示，在AS的早期病变中，中膜平滑肌就能合成MCP-1，并且在AS的各个时期SMC都可通过分泌MCP-1而引起血液单核细胞迁移至血管壁，促进动脉粥样硬化损伤的形成，抑制MCP-1或阻断其受体CCR2能抑制血管中层平滑肌细胞增殖迁移，研究雌激素对于VSMC的MCP-1表达的影响及产生的机制，对于抑制动脉粥样硬化的进展有一定意义。本研究拟采用siRNA干扰技术、免疫印迹检测、免疫荧光检测、酶联免疫吸附检测等分子生物学手段，从细胞和分子水平观察17β-雌二醇(E2)对LPS诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)MCP-1表达和细胞迁移的影响，并对与之相关的信号通路进行探讨，从而为雌激素抑制动脉粥样硬化的机制提供新的资料，也为临床治疗动脉粥样硬化提供新的作用靶点。
　　 本研究分为两个部分，第一部分：从细胞和分子水平探讨E2对LPS诱导的大鼠血管平滑肌细胞MCP-1表达和细胞迁移的影响及cav-1蛋白、p38MAPK、NF-κB通路在LPS诱导的MCP-1表达和细胞迁移中的作用。划痕法测定大鼠VSMC迁移距离结果表明，应用LPS24小时后促进大鼠血管平滑肌细胞迁移，较对照组迁移距离增加；E2预孵育24小时抑制LPS诱导的平滑肌细胞迁移距离增加；使用MCP-1的中和剂anti-MCP-1 antibody可以降低LPS诱导的细胞迁移距离增加，提示LPS诱导的细胞迁移距离增加与MCP-1的表达有关。E2与MCP-1的中和剂anti-MCP-1antibody联合使用，并未增强anti-MCP-1antibody的作用，表明E2对LPS诱导的血管平滑肌细胞迁移距离增加的抑制主要与MCP-1相关。ELISA检测细胞培养上清液MCP-1的表达显示：LPS能以时间和浓度依赖的方式促进MCP-1的表达，随着LPS浓度的增加(0.01-10μg/m1)，MCP-1的产生增加，LPS作用6小时即可引起MCP-1表达的升高，24小时达高峰，之后有所下降，最高可达对照组6倍以上；17β-雌二醇抑制LPS诱导的MCP-1表达：10-9mol/L至10-6mol/L17β-雌二醇预孵育24小时，可以明显抑制VSMC上MCP-1的生成，抑制率分别为49.5％，46.6％，43.3％，39.1％；10-8mol/L17β-雌二醇预孵育12h，24h，48h也能抑制LPS诱导的MCP-1的生成，抑制率分别为36.3％，40.1％，43.2％，表明17β-雌二醇通过抑制MCP-1的表达抑制平滑肌细胞迁移。使用信号通路阻断剂对LPS诱导MCP-1生成的机制研究表明：以β-MCD破坏caveolae的结构，降低cav-1的表达；使用p38MAPK磷酸化的抑制剂SB203580，抑制p38MAPK的磷酸化；使用PDTC抑制NF-κB激活均能抑制LPS诱导的MCP-1表达，抑制率分别达到46.1％，51.5％，54.5％。应用siRNA干扰技术在血管平滑肌细胞分别转染cav-1 siRNA抑制cav-1表达、NF-κBp65 siRNA抑制NF-κB转录激活、p38MAPK siRNA抑制p38MAPK的磷酸化，也同样抑制LPS诱导的MCP-1表达，抑制率为48.6％，52.5％，55.8％，提示cav-1蛋白、p38MAPK通路、NF-κB通路在LPS诱导的MCP-1表达，以及由MCP-1增加所引起的血管平滑肌细胞迁移中有重要作用。
　　 第二部分：探讨cav-1蛋白、p38MAPK、NF-κB通路在17β-雌二醇抑制LPS诱导的MCP-1表达和细胞迁移中的作用。应用siRNA干扰技术及免疫印迹法检测蛋白表达情况显示，与第一部分抑制cav-1蛋白表达、抑制p38MAPK磷酸化、抑制NF-κB的激活，能抑制LPS诱导的MCP-1表达的结果一致，LPS诱导cav-1蛋白表达的升高、促进p38MAPK的磷酸化以及NF-κBp65的核转位激活。用雌激素受体拮抗剂ICI182780阻断17β-雌二醇的效应，能逆转17β-雌二醇对LPS诱导的cay-1蛋白表达的升高、p38MAPK的磷酸化以及NF-κBp65的核转位激活的抑制，雌激素受体α的选择性激动剂PPT能模拟17β-雌二醇的效应，雌激素受体β的选择性激动剂DPN则不能，提示17β-雌二醇能通过与其受体结合抑制p38MAPK磷酸化、NF-κB的核转位激活以及cav-1蛋白的表达，抑制LPS诱导的MCP-1的生成的，雌激素受体α起主要作用。其中p38MAPK的磷酸化介导NF-κBp65的核转位激活，而cav-1蛋白的表达又是NF-κB依赖的。
　　 综上所述，本研究以LPS诱导血管平滑肌细胞的炎症损伤，观察17β-雌二醇对LPS诱导的MCP-1表达和血管平滑肌细胞迁移的影响，并探讨这一影响存在的内在机制。结果表明：LPS可诱导血管平滑肌细胞MCP-1的表达，并通过MCP-1的表达促进血管平滑肌细胞的迁移；17β-雌二醇可抑制LPS诱导的血管平滑肌细胞迁移，这一抑制作用与抑制MCP-1的产生有关；17β-雌二醇在血管平滑肌细胞上所显示的对抗LPS诱导的MCP-1的产生，以及由MCP-1诱导的平滑肌细胞迁移的效应，是通过其受体发挥作用的，雌激素受体α起主要作用，并与p38 MAPK、NF-κB/Cav-1通路有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩写对照表

声明

前言

第一部分 17β-雌二醇对LPS诱导的大鼠血管平滑肌细胞MCP-1表达和细胞迁移的影响及机制

1.1引 言

1.2材料方法

1.3实验结果

1.4讨 论

1.5小 结

参考文献

附 图1

第二部分 cav-1蛋白，p38MAPK、NF-κB通路在17β-雌二醇抑制LPS诱导的血管平滑肌细胞MCP-1表达和细胞迁移中的作用

2.1引 言

2.2材料方法

2.3实验结果

2.4讨论

2.5小 结

参考文献

附 图2

结论

参加会议及发表论文情况

Caveolin-1在炎症反应中的作用

参考文献

致谢