褐飞虱遗传多样性及其海藻糖合成酶基因功能的分析

摘要

褐飞虱(Nilaparvata lugens)是我国和许多亚洲国家当前水稻上的首要害虫，自20世纪70年代以来时有暴发，严重影响稻谷产量。褐飞虱有远距离迁飞的特性，每年3-4月份，褐飞虱开始从境外迁入我国。因此，褐飞虱的迁飞特性是造成其在我国暴发的根本原因。本课题以褐飞虱的迁飞为主线，从两个方面开展相关研究，包括(1)利用高通量Solexa测序技术，对5个地理种群，包括越南河静、菲律宾内湖、广东珠海、安徽潜山、云南思茅的褐飞虱基因组上＜5％的序列进行测序，对其共有的单核苷酸多态性位点(single nucleotidepolymorphism,SNPs)的存在方式和频率进行分析，构建褐飞虱种群内和种群间的遗传分化关系，探讨此方法在研究季节性长距离迁飞昆虫褐飞虱的迁飞过程的可行性；(2)利用饲喂法RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术研究褐飞虱飞行能量相关基因海藻糖合成酶(Trehalose phosphate synthase，TPS)的功能。论文取得的主要结果如下：
　　 1.建立了对基因组序列未知昆虫的经济有效的高质量单核苷酸多态性位点的获得方法。对5个褐飞虱种群全基因组序列进行测序的费用是极其昂贵的，本研究建立了选取基因组上＜5％的基因组序列进行测定的方法，每个种群只测定1G的数据量。测序质量的评估表明该方法准确性高，能获得高通量的SNPs位点信息。
　　 2.构建了褐飞虱种群内和种群间的遗传分化关系。
　　 1)将5个地理种群中满足覆盖度大于等于50倍覆盖度及至少一个种群的SNP的频率(minor allele frequency,MAF)＞0.05或MAF≠0的SNPs位点做两两种群间的欧式距离分析，结果显示，在大于等于50倍覆盖度时，广东珠海、安徽潜山、及云南思茅这三个地理种群的相对距离最近，菲律宾与其它四个种群间的相对距离最远。
　　 2)聚类分析的结果表明，安徽潜山种群与广东珠海种群在MAF＞0.05条件选择与否的情况下都聚为最近的一支，越南河静种群与云南思茅种群最靠近，表明这两个种群关系最近；而菲律宾内湖种群处于聚类的最外端，与其它四个地理种群的差异最大，比越南种群与其它三个国内的地理种群更远。
　　 3)在5个种群中，种群间的遗传分化系数(coefficient of gene differentiation,Fst)的值在0.0046-0.0088之间，即绝大部分变异存在于各种群内，说明种群间遗传分化程度非常低。Fst的结果与5个地理种群欧式距离的结果和趋势一致，即菲律宾内湖种群与其它四个地理种群的Fst值都是最大的，由Fst间接换算的基因流Nm在5个地理种群之间达到了28-54之间，远大于1，说明5个种群间的基因流较大。
　　 3.利用饲喂法RNAi技术，发现海藻糖合成酶对褐飞虱的生长发育有重要作用。RNAi目前已经被广泛地用来研究昆虫基因的功能，其靶标的特异性及高效性也使其成为控制害虫的新方法。在本研究中，首先从褐飞虱中成功克隆到了海藻糖合成酶基因，该基因全长3235bp，编码一个807个氨基酸的蛋白。该基因主要在脂肪体中表达，在中肠和卵巢也有微量表达。定量PCR的结果显示TPS基因在褐飞虱若虫至成虫阶段都有恒定且持续的表达。通过对褐飞虱持续饲喂NlTPSdsRNA的方式，发现在对3龄褐飞虱若虫饲喂0.5μg/μl dsRNA(终浓度)2天后其靶标基因的表达即有了明显的下降，在取食4天、7天及10天时NlTPS的表达依然被抑制，并且海藻糖合成酶的酶活在饲喂NlTPS dsRNA2天后也出现了下降，到第7天时，其酶活下降到初始酶活的一半；目标基因表达水平的显著下降对褐飞虱的生长发育产生了重要影响，产生了致死表型，在饲喂靶标基因dsRNA2天、4天、7天和10天后的平均存活率为75.56％、64.44％、55.56％和40.00％，与对照组之间的存活率存在显著的差异。

目录

文摘

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声明

第一章前言

1.1褐飞虱的危害及其迁飞研究

1.1.1褐飞虱的危害

1.1.2褐飞虱的迁飞

1.2昆虫海藻糖合成酶的研究概况

1.2.1海藻糖的功能

1.2.2海藻糖的合成与海藻糖合成酶的研究进展

1.2.3昆虫海藻糖与迁飞的关系

1.3 RNAi的研究概况

1.3.1 RNAi的概述

1.3.2 RNAi的作用机制及特点

1.3.3昆虫中RNAi的实现方法

1.3.4 RNAi在昆虫研究中的应用

1.4昆虫遗传多样性的研究概况

1.4.1遗传多样性的概述

1.4.2遗传多样性的检测方法

1.4.3 SNPs分子标记的检测方法

1.4.4 SNPs分子标记在昆虫中的研究

1.5本论文的意义

第二章褐飞虱地理种群的遗传多样性分析

2.1材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2主要试剂和溶液

2.1.3主要仪器

2.1.4实验方法

2.2结果与分析

2.2.1褐飞虱基因组DNA的提取

2.2.2褐飞虱基因组DNA的酶切

2.2.3酶切片段的回收及浓度测定

2.2.4测序样品的回收

2.2.5测序结果的评价

2.2.6酵母序列的抽提

2.2.7褐飞虱测序结果的拼接

2.2.8单核苷酸多态性位点的确定

2.2.9单核苷酸多态性位点的频率分布

2.2.10褐飞虱遗传多样性分析

2.3 讨论

2.3.1 单核苷酸分子标记

2.3.2 Solexa测序技术

2.3.3褐飞虱地理种群多样性

2.4本章小结

第三章褐飞虱海藻糖合成酶基因的克隆和时空表达

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2主要试剂和溶液

3.1.3主要仪器设备

3.1.4实验方法

3.2结果与分析

3.2.1褐飞虱TPS cDNA的克隆和分析

3.2.2褐飞虱TPS mRNA的组织分布

3.2.3褐飞虱TPS mRNA的时间表达

3.3讨论

3.4本章小结

第四章海藻糖合成酶对褐飞虱生长发育的影响

4.1材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2主要试剂

4.1.3主要仪器

4.1.4实验方法

4.2结果与分析

4.2.1 dsRNA的合成结果

4.2.2饲喂dsRNA对褐飞虱存活率的影响

4.2.3饲喂dsRNA对褐飞虱NITPS mRNA表达水平的影响

4.2.4饲喂dsRNA对褐飞虱海藻糖合成酶酶活的影响

4.3讨论

4.4本章小结

第五章总结与展望

本论文的创新点

参考文献

附录

致谢