来自深海宏基因组的盐耐受相关基因的筛选及克隆

摘要

深海环境通常具有高盐，高压，低温，无光照等特点，其海底沉积物的微生物往往具有适应特殊环境的独特生理代谢机制和分子细胞结构。其特定的生态环境蕴藏着独特而又极其丰富的微生物资源，其中大部分还鲜为人知，为研究中度嗜盐菌盐适应机制提供了新的材料。面对海洋环境中随时存在的失去胞内外渗透压平衡的威胁，大部分微生物在长期的进化过程中形成了其独特的应对机制，其中最重要的就是大多数中度嗜盐菌通过在胞内积累相容性溶质来调节渗透压的变化并维持细胞正常的代谢活动。由于这是一种非常灵活的短期或瞬变的反应，随外界渗透压的变化而变化，它成为目前微生物渗透压研究的模型和热点。
　　 在文库筛选过程中发现一株在6％NaCl浓度LB培养基中生长良好的克隆子FOS36K，在分析FOS36K的外源片段酶切图谱的基础上，选用BamHⅠ和NheⅠ依次进行两次亚克隆，将FOS36K质粒外源片段大小从36K缩小至9K，获得了一株同样有耐盐特性的亚克隆FOS9K。分析FOS9K外源片段序列，含有六个ORF，推测耐盐特性的产生与其中ORF6(命名为putP-sea)单个基因的表达产物有关。putP-sea基因编码产物为492个氨基酸，分子量约为53 kDa。通过互联网对PutP-sea蛋白分别进行了氨基酸疏水性分析，发现PutP-sea蛋白存在11个疏水区，说明PutP-sea蛋白是1个跨膜蛋白。将ORF6的序列在Genbank中用Blast软件进行同源性比较，结果表明ORF6编码的蛋白质序列与Idiomarina balticaOS145来源的Na+和脯氨酸转运子(PutP)有82％的相似性。通过PCR的方法把包括整个putP-sea基因ORF框及可能的启动子核苷酸序列在内的2.2kb的片段克隆到pBR322载体上，构建了重组质粒pBRputP-sea，转化E.coli EPI300后得到转化子为EPI/pBRputP-sea，其耐盐特性和原始克隆子FOS36K类似，为此本研究认为ORF6为耐盐相关基因。
　　 本研究使用了Red同源重组技术，在E.coli EPI300菌株中通过敲除染色体上的putP基因，构建putP基因缺失的新菌株EPI-△putP。该菌株在含脯氨酸为单一碳源的M8基本培养基上不能生长，而将pBRputP-sea重组质粒转入到EPI-△putP中，使该菌株在含脯氨酸为单一碳源的M8基本培养基上生长。说明putP-sea基因具有将外界脯氨酸转运至胞内的功能。在不同NaCl浓度的LB培养基中测定四种菌株胞内自由脯氨酸含量，发现EPI/pBRputP-sea和EPI-△putP/pBRputP-sea在一定NaCl浓度范围内脯氨酸转运量的多少和培养基中的盐浓度呈正相关，而EPI/pBR322和EPI-△putP/pBR322不相关。说明了putP-sea基因表达受外界渗透压调控，通过提高脯氨酸的转运量来提高耐盐能力。

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论文说明:缩略词

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第一章 绪论

1.1 中度嗜盐菌研究进展

1.1.1 中度嗜盐菌的主要类群

1.1.2 中度嗜盐菌的分布

1.1.3 中度嗜盐菌的渗透调节机制

1.2 相容性溶质研究进展

1.3 脯氨酸的代谢

1.3.1 脯氨酸的合成

1.3.2 脯氨酸的转运

1.4 宏基因组方法

1.4.1 宏基因组的定义

1.4.2 宏基因组文库的构建

1.4.3 宏基因组文库的筛选

1.5 本研究目的与意义

第二章 盐耐受性相关基因(簇)初步筛选

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.3 结果与分析

2.3.1 pCC1FOS空质粒的构建

2.3.2 含空质粒宿主菌盐耐受性测定

2.3.3 具有盐耐受重组克隆子的筛选

2.3.4 耐盐克隆子质粒的提取与酶切鉴定

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 盐耐受相关基因的亚克隆和鉴定

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.3 结果与分析

3.3.1 亚克隆质粒构建及筛选

3.3.2 putP-sea基因的确定

3.3.3 putP-sea基因的生物信息学分析

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 putP-sea基因功能研究

4.1 前言

4.1.1 同源重组研究进展

4.1.2 Red 同源重组的作用机理

4.1.3 Red 同源重组的操作方法

4.1.4 Red 同源重组的消除

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 方法

4.3 结果与分析

4.3.1 putP破坏的线性片段KanR(ΔputP：：kan)片段的获得

4.3.2 基因敲除菌株的筛选

4.3.3 功能互补实验

4.3.4 脯氨酸积累量的测定

4.4 讨论

4.5 小结

参考文献

已发表文章

致谢