PKCα，PI3K/AKT和MAPK信号激活在Tamoxifen引起C6神经胶质瘤细胞凋亡过程中作用机制的研究

摘要

目的：
　　 在神经胶质瘤的多种术后辅助性治疗中，化学疗法被认为有助于提高患者生存率。Tamoxifen(TAM，他莫昔芬)作为抗肿瘤药物，被广泛应用于雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性的乳腺癌的治疗。但近年来的研究发现，TAM也能用于ER阴性的肿瘤化疗，包括神经胶质瘤，但其作用机制和在治疗过程中对正常星形胶质细胞的影响并不十分清楚。
　　 本课题应用TAM处理正常大鼠星形胶质细胞和大鼠C6神经胶质瘤细胞(C6细胞)，观察处理过程对两种细胞的影响及PKCα、ERK、JNK等蛋白磷酸化水平的变化；并探讨PI3K/Akt和MAPK信号的激活在TAM导致C6细胞凋亡过程中所起的作用及这两条通路之间的关系，为临床联合应用相关信号抑制剂与TAM治疗神经胶质瘤提供一定的实验室依据。
　　 方法：
　　 1.新生SD大鼠星形胶质细胞和C6大鼠神经胶质瘤细胞的培养、鉴定：(1)解剖显微镜下分离出生1-3d SD大鼠大脑皮质，剪碎组织，0.25％胰酶消化，过滤后，完全培养基差速贴壁30min;然后将上清内的细胞贴壁培养7～10d后，置于37℃恒温摇床，250rpm摇24h，胰酶消化传代；待第二代细胞90％融合时用胰酶消化后，加入完全培养基差速贴30min，将上清转移至新培养瓶，进行第三代星形胶质细胞的培养，GFAP抗体鉴定细胞。(2)10％FBS DMEM培养基培养C6细胞，90％融合时用胰酶消化，调节细胞密度为(3～5)×105/ml传代。GFAP抗体鉴定细胞。
　　 2.TAM对正常大鼠星形胶质细胞C6大鼠神经胶质瘤细胞的影响：不同浓度TAM(0～40μM)作用正常大鼠星形胶质细胞和C6细胞24h，细胞计数方法计算细胞死亡率，核荧光染色和DNA ladder鉴定凋亡，FACs方法检测细胞凋亡率。
　　 3.Westem Blotting检测正常大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中PKCα和PKCδ的蛋白表达差异；20μM TAM经不同时间点(0～60min)作用两种细胞，检测细胞中PKCα、ERK、JNK等蛋白磷酸化水平的变化。
　　 4.20μM TAM经不同时间点(0～24h)作用C6细胞后，检测细胞中Akt、ERK、JNK等蛋白磷酸化水平的变化；Akt、ERK、JNK的蛋白激酶抑制剂分别单独或与TAM联合应用24h，FACs方法检测细胞凋亡率；Akt、ERK、JNK的蛋白激酶抑制剂分别单独或与TAM联合应用12h，观察细胞中Akt、ERK、JNK等蛋白磷酸化水平的改变。
　　 结果：
　　 1.体外培养的大鼠星形胶质细胞贴壁生长，胞体较大，有多条突起；经机械振荡和两次差速贴壁可以得到数量较多的、纯化的大鼠星形胶质细胞，免疫荧光显示为GFAP强阳性；普通培养条件下的C6细胞贴壁生长，胞体较小，少见双核或多核，核浆比大，有多条细长突起，免疫荧光显示GFAP阳性。
　　 2.TAM能引起C6胶质瘤细胞凋亡，引起大鼠星形胶质细胞死亡但不引起其凋亡。
　　 3.大鼠星形胶质细胞PKCα的表达明显低于C6细胞，而PKCδ的表达则没有差异。
　　 4.在正常大鼠星形胶质细胞中，PKCα的磷酸化水平在1h内没有明显改变，而JNK和ERK的磷酸化水平则是先下降，30min时达峰值，然后又下降；在C6细胞中，PKCα、JNK和ERK的磷酸化水平都是随时间延长逐渐升高，其中ERK和JNK的变化更明显。
　　 5.TAM作用24h内引起C6细胞中Akt、JNK和ERK不同时间点磷酸化水平的改变。Akt的磷酸化水平随TAM作用时间的延长持续下降，12h后稳定；JNK的磷酸化水平在1h达峰值，然后下降并维持较高的磷酸化水平到24h；ERK的磷酸化水平随TAM作用时间的延长持续升高，12h达峰值，然后下降并维持较高的磷酸化水平。
　　 6.Akt、JNK和ERK的蛋白激酶抑制剂与TAM联合作用，均可促进TAM所诱导的C6细胞的凋亡；PI3K/Akt的抑制剂LY294002单独使用可增加ERK的磷酸化水平，与TAM协同作用后明显抑制ERK的磷酸化表达；JNK的抑制剂SP600125能够下调Akt、增强ERK的磷酸化水平；ERK的抑制剂PD98059可以抑制JNK的磷酸化表达。
　　 结论：
　　 1.经过改良的体外培养方法可以得到数量多、纯度高的正常大鼠星形胶质细胞。
　　 2.TAM能引起C6胶质瘤细胞凋亡，引起大鼠星形胶质细胞死亡但不引起其凋亡。
　　 3.PKCα和MAPK信号通路参与了TAM引起C6胶质瘤细胞的死亡；而MAPK信号通路参与了TAM所引起大鼠星形胶质细胞的死亡。
　　 4.PI3K/Akt和MAPK信号通路参与TAM引起C6胶质瘤细胞凋亡并起拮抗凋亡的作用；PI3K/Akt、JNK和ERK的抑制剂与TAM联合作用可显著提高TAM对胶质瘤的促凋亡作用；PI3K/Akt、JNK和ERK之间相互影响并构成调节环路。

目录

文摘

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引 言

第一章 SD大鼠星形胶质细胞与大鼠C6神经胶质瘤细胞的培养及鉴定

1.1.材料

1.2.方法

1.3.结果

1.4.讨论

第二章 Tamoxifen对C6细胞和正常大鼠星形胶质细胞的影响

2.1.材料

2.2.方法

2.3.结果

2.4.讨论

第三章 PKCα和MAPK在TAM引起C6细胞和正常大鼠星形胶质细胞死亡中的作用

3.1.材料

3.2.方法

3.3.结果

3.4.讨论

第四章 PI3K／Akt和MAPK信号通路在TAM引起C6细胞凋亡过程中的磷酸化改变及两条通路的相互关系

4.1.材料

4.2.方法

4.3.结果

4.4.讨论

结论

附图

博士研究生期间发表文章（2005-2010）：

参考文献

致谢