ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位点及激活机理研究

摘要

高血压脑卒中是我国发病率高、危害大的心脑血管疾病。脑血管重构是脑卒中一个关键的病理变化。平滑肌细胞的增殖、凋亡是脑血管重构的重要因素。本文旨在研究血管平滑肌细胞ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位点及激活机理。实验分为三个部分：
　　 第一章：ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位点鉴定。
　　 本部分首先采用免疫沉淀的方法研究低渗刺激下ClC-3蛋白酪氨酸磷酸化变化情况。结果表明：
　　 ⑴稳定表达HA与ClC-3融合蛋白(HAClC-3)的A10细胞用低渗液和等渗液分别处理90s后，用antiHA antibody将HAClC-3融合蛋白免疫沉淀，用antiphosphotyrosine antibody进行免疫印迹。结果发现，与等渗处理90s相比，低渗刺激90s后HAClC-3蛋白的酪氨酸磷酸化水平明显增强。
　　 ⑵经系统的生物信息学分析ClC-3蛋白序列后发现，在ClC-3蛋白上主要存在3个酪氨酸残基位点可能发生磷酸化，分别为接近N端284位酪氨酸残基(Y284)，位于C端的572和631位酪氨酸残基(Y572和Y631)。
　　 ⑶Y631F突变对表达的容积调节性氯电流的性质(整流性和电压依赖性和时间依赖性失活)没有明显影响。经单因素方差分析，A10组、GFP空载体组、GFPClC-3组、GFPClC-3Y631F突变体组在等渗和低渗时±80mV的电流密度均有明显差异(p＜0.05)。
　　 ⑷经单因素方差分析，A10组、GFP空载体组、GFP ClC-3组、GFPClC-3Y631F突变体组在等渗时的胞内氯浓度没有明显差异(p＞0.05)，而在低渗时的胞内氯浓度有明显差异(p＜0.05)。
　　 ⑸Y572F突变对表达的容积调节性氯电流的性质(整流性和电压依赖性和时间依赖性失活)没有明显影响。经单因素方差分析，A10组、GFP空载体组、GFPClC-3组、GFPClC-3Y572F突变体组在等渗和低渗时±80mV的电流密度均有明显差异(p＜0.05)。
　　 ⑹经单因素方差分析，A10组、GFP空载体组、GFP ClC-3组、GFPClC-3Y572F突变体组在等渗时的胞内氯浓度没有明显差异(p＞0.05)，而在低渗时的胞内氯浓度有明显差异(p＜0.05)。
　　 ⑺经单因素方差分析，A10组、GFP空载体组、GFPClC-3组、GFPClC-3Y284F突变体组在等渗和低渗时±80mV的电流密度均有明显差异(p＜0.05)。
　　 ⑻经单因素方差分析，A10组、GFP空载体组、GFPClC-3组、GFPClC-3Y284F突变体组在等渗时的胞内氯浓度没有明显差异(P＞0.05)，而在低渗时的胞内氯浓度有明显差异(p＜0.05)。
　　 ⑼Y631Y572F突变对表达的容积调节性氯电流的性质(整流性和电压依赖性和时间依赖性失活)没有明显影响。
　　 小结：①低渗刺激后ClC-3蛋白酪氨酸磷酸化水平增加。②应用生物信息学分析发现ClC-3蛋白主要存在三个酪氨酸残基可能发生磷酸化，分别是Y284，Y572，Y631。③Y631F突变对容积调节性ClC-3氯电流和容积调节性ClC-3氯运动没有明显影响。④Y572F突变可以减弱容积调节性ClC-3氯电流和容积调节性ClC-3氯运动。⑤Y284F突变显著减弱容积调节性ClC-3氯电流和容积调节性ClC-3氯运动。⑥Y631FY572F双位点突变体表达的容积调节性氯电流与Y631F单突变体表达电流相比有明显差异，而与Y572F单突变体表达电流相比没有明显差异。⑦Y631FY284F双位点突变体表达的容积调节性氯电流与Y631F单突变体表达电流相比有明显差异，而与Y284F单突变体表达电流相比没有明显差异。⑧Y572FY284F双位点突变体表达的容积调节性氯电流与Y572F单突变体表达电流相比有明显差异，而与Y284F单突变体表达电流相比没有明显差异。⑨Y631FY572FY284F三位点突变体表达的容积调节性氯电流与Y631F单突变体表达电流相比有明显差异，与Y572F单突变体表达电流相比也有明显差异，而与Y284F单突变体表达电流相比没有明显差异。⑩Y284D突变显著增强容积调节性ClC-3氯电流和容积调节性ClC-3氯运动。
　　 第二章：功能位点突变对ClC-3氯通道保护细胞凋亡作用的影响。
　　 通过在A10细胞上转染Y284F,Y284D两种ClC-3突变体和正常ClC-3 cDNA，运用核Hoechst染色及Anexin V和PI双染技术，研究突变对容积调节性ClC-3通道保护TG和H2O2诱导的A10细胞凋亡的功能的影响。结果如下：
　　 ⑴分别用25μM，50μM,100μM，200μMTG处理A10细胞24h后进行核Hoechst染色发现，25μM处理组部分细胞开始出现核体积缩小，荧光染色增强，少数细胞呈现染色质浓染和凋亡小体；100μM处理组出现显著的细胞凋亡(核固缩，核碎裂，可见明显的凋亡小体)；200μM处理组出现30％以上的细胞死亡漂浮于细胞培养液，未做进一步的核Hoechst染色。故后续实验采用100μMTG诱导细胞凋亡。
　　 ⑵分别用50μM，100μM,200μM,400μM H2O2处理A10细胞24h后进行核Hoechst染色发现，100μM处理组开始出现细胞凋亡，200μM处理组出现显著的细胞凋亡，400μM处理组出现15％以上的细胞死亡漂浮于细胞培养液，未做进一步的核Hoechst染色。故后续实验采用200μM H2O2诱导细胞凋亡。
　　 小结：①ClC-3可以保护TG和H2O2诱导的A10细胞凋亡。②Y284F突变可以显著减弱ClC-3对TG诱导的A10细胞凋亡的保护作用，而Y284D突变可以增强ClC-3对TG诱导的A10细胞凋亡的保护作用。③Y284F突变可以显著减弱ClC-3对H2O2诱导的A10细胞凋亡的保护作用，而Y284D突变可以增强ClC-3对H2O2诱导的A10细胞凋亡的保护作用。
　　 第三章：ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化的激活机制。
　　 研究ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化的Src激酶依赖的激活机制，运用Src激酶选择性抑制剂和基因转染技术，研究Src激酶对ClC-3通道介导的氯电流和氯运动的调节作用，并运用免疫共沉淀的方法探讨Src激酶与ClC-3蛋白的相互作用。结果如下：
　　 ⑴在大鼠基底动脉平滑肌细胞、主动脉平滑肌细胞及A10胚胎鼠主动脉平滑肌细胞株上都可检测到Src蛋白的表达。
　　 ⑵在±80mV，低渗刺激后细胞的电流密度分别从等渗条件下的-9.0±2.4pA·pF-1和15.6±3.2pA·pF-1增加至-22.2±6.0 pA·pF-1和46.5±10.0 pA·pF-1(n=16，P＜0.01)。
　　 ⑶在±80mV，低渗刺激后细胞的电流密度分别从等渗条件下的-16.5±4.2pA·pF-1和34.9±8.5 pA·pF-1增加至-53.1±15.7 pA·pF-1和102.6±19.4 pA·pF-1(n=13，P＜0.05)。
　　 ⑷SrcA(活性形式Src激酶)和SrcI(非活性形式Src激酶)质粒分别转染A10细胞，进行全细胞电流记录。未转染的A10细胞组在等渗时的基础电流在±80mV时分别为-6.5±2.3 pA·pF-1和14.2±3.1 pA·pF-1(n=16)，转染空载体的A10细胞组在等渗时的基础电流在±80mV时分别为-6.9±2.5 pA·pF-1和14.8±4.6pA·pF-1(n=6)，与未转染的A10细胞组相比没有明显区别。
　　 ⑸A10细胞在等渗时细胞内氯离子浓度为30.49±1.01mM(n=30)，在低渗刺激下A10细胞内氯离子浓度下降到24.17±1.03mM，氯离子浓度下降值为6.32±0.44 mM，下降率为20.72±2.53％(n=30)。
　　 小结：①血管平滑肌细胞存在Src蛋白表达。②Src蛋白酪氨酸激酶选择性抑制剂SU6656可以浓度依赖性地抑制A10细胞和过表达ClC-3蛋白的A10细胞的容积调节性的氯电流。③活性形式的Src蛋白酪氨酸激酶增强A10细胞容积调节性的氯电流；非活性形式的Src蛋白酪氨酸激酶抑制A10细胞容积调节性的氯电流。④过表达活性的Src蛋白酪氨酸激酶增强A10细胞容积调节性氯运动，过表达非活性的Src蛋白酪氨酸激酶抑制A10细胞容积调节性氯运动。⑤Src激酶与ClC-3氯通道存在蛋白质的相互作用。⑥我们结果提示Y284，Y572是Src激酶调控ClC-3氯通道的关键功能位点。
　　 结论：
　　 ⑴Y284，Y572是ClC-3氯通道关键的酪氨酸磷酸化功能位点，Y284，Y572位点的磷酸化可以增强ClC-3氯通道活性，以Y284位点的作用尤为显著。
　　 ⑵ClC-3可以保护TG和H2O2诱导的A10血管平滑肌细胞的凋亡。Y284F突变可以显著减弱ClC-3对细胞凋亡的保护作用，Y284D突变可以显著增强ClC-3对细胞凋亡的保护作用，提示功能位点相关的酪氨酸磷酸化信号对ClC-3参与的细胞凋亡等多种生理过程有重要影响。
　　 ⑶Src激酶直接参与了ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位点(Y284，Y572)相关的通道激活机制，Src激酶直接与ClC-3氯通道结合，并磷酸化Y284，Y572位点介导了容积调节性氯通道的活性和功能调节。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写对照表

声明

前 言

第一部分 ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位点鉴定

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分功能位点突变对ClC-3保护细胞凋亡作用的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分ClC-3通道酪氨酸磷酸化相关的激活机制

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

结 论

创新与意义

附 表

附 图

参考文献

综述容积调节性ClC-3氯通道激活机理研究进展

个人简历

发表的论文

致谢