海洋微生物来源新型化合物Xyloketal B对双肾双夹高血压大鼠模型血压的影响及机制初探

摘要

随着人口老龄化时代的到来，高血压等心脑血管疾病成为了当今危及人类健康和生命的最主要疾病之一，给社会和家庭带来了沉重的经济和精神负担。
　　 众所周知，钙通道阻滞剂(Ca2+ channel blockers，CCBs)在心脑血管疾病治疗领域有很高的研究价值和市场价值，并且海洋心脑血管药物研究在药学研究和生物技术研究领域占有越来越显著的地位，目前已有多种药物得到开发和应用。
　　 本研究首先采用胸主动脉离体血管环实验对这一类xyloketals化合物中的Xyloketal A、Xyloketal B、Xyloketal F三种在新生大鼠海马神经细胞实验中有较强L-型Ca2+通道阻滞作用的化合物进行离体组织水平上的药效学初筛，发现只有Xyloketal B在离体器官水平上药效学比较明显，能够对高K+和苯肾上腺素(Phenylephrine，Phe)诱导的胸主动脉离体血管环收缩反应有明显的抑制作用。随后在双肾双夹易卒中型肾血管性高血压大鼠(2 kidney 2 clips stroke-prone renovascular hypertensive rats,RHRSP)模型上证实XyloketalB能够降低RHRSP大鼠血压。最后在胸主动脉离体血管环、胸主动脉血管平滑肌细胞和血管内皮细胞上对Xyloketal B的药效学进行机制初探，为XyloketalB后续研究提供理论依据。
　　 一、实验方法
　　 1.离体血管环实验药效学初筛
　　 采用正常雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，分离雄主动脉并制备血管环，在血管环稳定后给予高K+(60mM)、Phe(1μM)刺激，洗脱后预孵后不同的化合物10分钟，再给予高K+(60mM)、Phe(1μM)刺激，对照空白及溶媒组，观察Xyloketal A、Xyloketal B、Xyloketal F对高K+和Phe引起的血管收缩作用的影响。
　　 2.Xyloketal B对RHRSP大鼠血压的影响
　　 选用鼠龄60-90天，体重90-120雄性SD大鼠57只，其中45只按双肾双夹法制备易卒中型肾血管性高血压大鼠模型，另外12只除不上银夹外，其余处理同手术组，作为假手术对照组。
　　 实验动物随机分6组，假手术组(Sham，n=12)；不上银夹，其余处理同高血压模型组；高血压模型组(Htn，n=14)；卡托普利给药组(Cap，100μg/kg/d，n=7)；Xyloketal B溶剂治疗组(含20％丙三醇生理盐水组，NS，n=11)；Xyloketal B治疗组(Xyl-B，20mg/kg/d，n=6)；尼莫地平给药组(Nim，100μg/kg/d，n=7)。药物治疗于术后第2天开始，每组术前经尾动脉测收缩压，术后每周测血压一次。用无创血压测量仪测尾动脉收缩压。每只鼠每次测三个值，取其平均值。术前三天测血压为基础血压，术后每周测血压一次。
　　 3.XyloketalB降压作用机制初探
　　 采用正常SD雄性大鼠分离制备血管环，待血管环稳定后采用XyloketalB和L-NAME共同孵浴后给予Phe刺激的方法，对比无L-NAME孵浴组观察XyloketalB对血管内皮的作用；相同办法探究吲哚美辛(Indomethin)，亚甲基兰(Methylene Blue)对Xyloketal B抑制血管环收缩反应作用的影响；机械法去除血管内皮，将浴槽内换成无钙Kreb's液，然后孵浴Xyloketal B 10分钟后给予Phe和Ryanodine刺激收缩，待到峰值后给予Ca2+，观察Xyloketal B对血管平滑肌细胞钙释放的影响。
　　 原代分离培养人脐静脉内皮细胞，使用Ⅱ-Ⅵ代细胞，在培养基中添加氚标L-精氨酸，再给予Xyloketal B孵浴15分钟、45分钟后用cGMP试剂盒测定L-胍氨酸的生成量，探究Xyloketal B对血管内皮细胞一氧化氮合成酶(eNOS)活性的影响。
　　 原代分离培养大鼠血管平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞，使用Ⅲ-Ⅵ代平滑肌细胞和Ⅱ-Ⅵ代人脐静脉内皮细胞，细胞分组分为平滑肌细胞组和平滑肌细胞与脐静脉内皮细胞混养组，处理分组分空白组、溶媒组、Xyloketal B组及阳性药物组硝普钠(SNP)，分别处理5分钟、30分钟、45分钟及60分钟，使用cGMP水平检测试剂盒测定此时平滑肌细胞中cGMP水平，探究Xyloketal B对平滑肌细胞内cGMP水平的影响。
　　 二、实验结果
　　 (一)对Xyloketal A、Xyloketal B、Xyloketal F在高K+和Phe引起离体胸主动脉血管环收缩活性的筛选
　　 经观察，实验中所使用的溶媒对高K+和Phe引起的血管收缩反应无明显影响；对照空白和溶媒组，Xyloketal B对高K+和Phe引起的血管收缩反应有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性。其中Xyloketal B在20μM时，对60mM的KCI诱导血管环收缩的抑制率为52.5±3.2％(n=6)，对10-6MPhe诱导血管环收缩作用抑制率为42.7±2.9％(n=6)，血管环有内皮情况下，Xyloketal B的IC50为19±2μM。而Xyloketal A与Xyloketal F则对高K+和Phe引起的血管收缩反应无明显的抑制作用，因此采用xyloketal B进行后续实验。
　　 (二)Xyloketal B对双肾双夹易卒中肾血管性高血压大鼠(RHRSP)血压的影响Sham组术后12周内血压维持在119±8mmHg～130±7mmHg；Htn组术后第2、4、8、12周血压缓慢升高，自第4周起Htn组与Sham组血压均值差异有显著性(156±9mmHgvs120±11mmHg，P＜0.05)；卡托普利(Cap)治疗后血压为116±11mmHg～135±16mmHg，与Sham组相比，差异无显著性(P＞0.05)，自第4周起Cap组的血压均值较Htn组血压均值显著降低(118±10mmHgvs156±9mmHg，P＜0.01)。Xyloketal B治疗后血压均值自第8周起较Htn组血压均值显著降低(P＜0.05)，第8周Sham组，Htn组，Xyloketal B组的血压均值分别为127±13mmHg，178±12mmHg，151±10mmHg；与同期Sham组相比，Xyloketal B组的血压均值偏高，但差异无显著性(P＞0.05)。各时间点NS组与Htn组血压均值差异无显著性(P＞0.05)，提示溶剂对高血压形成无影响。
　　 (三)Xyloketal B抑制血管收缩功能的内皮依赖性
　　 在实验中发现，20μMXyloketal B在机械法去除内皮和内皮完整组上对Phe诱导的血管环收缩的抑制作用分别为28.5±1.9％(n=6)和46.4±3.1％(n=6)，而20μM的XyloketalB在有无L-NAME预孵时对Phe诱导的血管环收缩的抑制作用分别为30±3.6％(n=6)和42.7±2.9％(n=6)，在无L-NAME孵育和有L-NAME孵育的情况下对Phe诱导的血管环收缩抑制作用的IC50分别为19±2μM和41±4μM，提示XyloketalB抑制血管收缩功能存在内皮依赖性与非内皮依赖性两种机制。
　　 Xyloketal B能够增强Ach舒张血管的作用(P＜0.05，n=7)，但对SNP引起的血管舒张作用无明显影响(P＞0.05，n=5)，10μMMethylene Blue对Xyloketal B抑制血管收缩作用则有明显影响(P＜0.05，n=6)，10μMIndomethin对10μM、20μM、40μMXyloketal B抑制血管收缩作用均无明显影响(P＞0.05，n=7)。
　　 (四)Xyloketal B对平滑肌细胞钙释放的影响
　　 Xyloketal B对Phe和Ryanodine诱导钙释放而引起的血管收缩都有一定的抑制作用，20μMXyloketal B对Phe诱导钙释放引起的血管收缩作用的抑制率为48.3±2.2％(n=6)，对Ryanodine诱导钙释放引起的血管收缩作用的抑制率为35.1±3.7％(n=6).
　　 (五)Xyloketal B对平滑肌细胞cGMP水平的影响
　　 XyloketalB对于单独平滑肌培养组中平滑肌细胞cGMP水平并无明显影响(P＞0.05，n=6)，但在平滑肌细胞和内皮细胞混养组平滑肌细胞中,20μmol/LXyloketal B组、40μmol/LXyloketal B组对比空白组和单独平滑肌细胞培养组cGMP水平明显增加(P＜0.05，n=6)。
　　 (六)Xyloketal B对人脐静脉内皮细胞eNOS活性的影响
　　 经测定，15min和45min时，与溶剂组相比，20μmol/L、40μmol/LXyloketal B能够浓度依赖性地升高细胞内L-精氨酸的转化率(P＜0.05，n=5)，但同浓度Xyloketal B对L-精氨酸的转化率的影响无时间依赖性(P＞0.05，n=5)。提示Xyloketal B可浓度依赖性增强人脐静脉内皮细胞eNOS活性。
　　 结论：
　　 海洋微生物来源新型化合物Xyloketal B对双肾双夹易卒中型肾血管性高血压大鼠具有降压作用，其降压作用可能与以下机制相关：降低血管平滑肌细胞电压依赖性与非电压依赖性Ca2+内流，影响血管平滑肌细胞内Ca2+释放，增强血管内皮eNOS活性，从而提高平滑肌内cGMP水平，促进血管扩张。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略语

声明

前言

Xyloketal A、Xyloketal B、Xyloketal F对血管收缩作用的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二章 Xyloketal B对双肾双夹易卒中型肾血管性高血压大鼠血压的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三章 Xyloketal B降压作用的机制初探

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢