阿托伐他汀促进小口径人工血管移植后快速内皮化的初步研究

摘要

血管移植术是治疗动脉狭窄或闭塞导致的组织缺血坏死重要的功能修复重建方法，人工血管是目前应用最为广泛的血管移植物。然而小口径人工血管移植后却因为容易发生血栓形成和内膜增生而严重限制了应用，促使人工血管表面尽快形成完整内皮层可以减少上述情况的发生，从而改善小口径人工血管的临床应用现状。血管内皮祖细胞是一种起源于骨髓的原始细胞，具有高度的分化增殖能力，可以定向分化为成熟的血管内皮细胞，参与人工血管内皮化过程。他汀类药物可以动员骨髓的内皮祖细胞，并且促进内皮祖细胞快速向缺血部位定向迁移和定植。然而，他汀类药物是否能促使人工血管表面尽快形成完整内皮层，从而提高人工血管移植术后通畅率至今仍未见报道。本实验通过构建犬人工血管-腹主动脉置换模型探讨他汀类药物对人工血管内皮化进程的作用，并通过观察他汀类药物对外周血VEGF以及EPCs数量和功能的影响进一步探讨他汀类药物促进内皮化进程的可能作用机制。
　　 第一部分阿托伐他汀对人工血管移植后内皮化进程的影响
　　 目的：构建犬人工血管-腹主动脉置换模型，探讨他汀类药物对人工血管移植后内皮化进程的作用。
　　 方法：将实验动物beagle犬随机分入实验组(阿托伐他汀钙，30mg/天)和对照组(空白对照)，给药两周后构建犬肾下腹主动脉-PTFE人工血管置换模型，采用血管彩色多普勒超声结合数字减影动脉造影(DSA)的方法检测术后人工血管通畅情况，分别于术后第4，8，12，24周活体取材，通过HE染色、免疫组化染色、扫描电镜等方法动态观察两组人工血管内皮化程度的差异，采用RT-PCR方法检测人工血管内表面内皮系细胞相关蛋白KDR和eNOS在mRNA水平上的表达情况。分别采用酶直接法和酶联免疫吸附实验法测定给药后第0，2，4，8，12，24周犬血浆LDL-c和VEGF水平。
　　 结果：共行35例犬腹主动脉-人工血管移植术，除外术后两周内死亡犬，共入组32只犬，其中每个时间点实验组和对照组均分别入组4只犬。术后实验组人工血管通畅率较对照组有所提高(P=0.023)。组织学检测提示实验组内皮化进程较对照组明显加快：4周时实验组人工血管内表面已经有内皮细胞沉积、附着，但尚不连续，而对照组基本上无内皮细胞沉积、附着；8周时实验组人工血管内表面已经形成一层连续的内皮细胞层，基本完成内皮化，而对照组只能在局部见到少量内皮细胞沉积；12到24周时两组内皮化都已基本完成，并已形成类似于自体血管的内膜、中膜的双层结构，对照组可以见到明显内膜增生，而实验组内膜增生不明显。扫描电镜结果也提示实验组在第8，12，24周内皮化程度均优于对照组(P4w=0.093，P8w=0.008,P12w=0.001,P24w=0.041)。实验组人工血管内表面内皮系细胞相关蛋白KDR和eNOS的mRNA水平表达较对照组提高。血浆LDL-c浓度较对照组明显降低(P=0.009)；实验组血浆VEGF水平较对照组稍有升高(P=0.004)。
　　 结论：阿托伐他汀钙加速了人工血管移植后的内皮化进程，并且提高了术后的通畅率；阿托伐他汀钙降低了犬血浆LDL-c浓度，同时上调了犬血浆VEGF水平。
　　 第二部分：阿托伐他汀钙促进犬人工血管内皮化机制的初步探讨
　　 目的：观察他汀类药物对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响，初步探讨他汀类药物加速内皮化进程的可能机制。
　　 方法：采用密度梯度离心法分离犬外周血单核细胞，在EBM-2培养基中定向诱导、扩增，实验组培养基中添加0.01mmol/L阿托伐他汀，对照组为空白对照。利用内皮祖细胞内吞ac-LDL和结合UEA-1的特性采用免疫荧光法鉴定内皮祖细胞并计数；采用胰蛋白酶消化法观察阿托伐他汀对内皮祖细胞黏附能力的影响；采用Transwell实验观察阿托伐他汀对内皮祖细胞迁移能力的影响；并通过RT-PCR方法了解阿托伐他汀对内皮祖细胞相关蛋白KDR和eNOS的mRNA表达水平的影响。
　　 结果：采用密度梯度离心法分离的犬外周血单核细胞为圆形悬浮细胞，定向诱导分化后细胞贴壁，体积逐渐增大，培养至第4天可以见到典型的纺锤型内皮祖细胞，培养至10天以上，细胞逐渐变为卵圆形的成熟内皮细胞。培养细胞部分呈内吞ac-LDL和结合UEA-1双阳性，实验组双阳性细胞计数较对照组明显增加(P4d=0.042；P7d=0.003；P10d=0.009)；实验组细胞黏附能力优于对照组(P4d=0.079；P7d=0.005；P10d=0.057)；实验组细胞迁移能力也优于对照组(P4d=0.006；P7d=0.003；P10d=0.004)；阿托伐他汀上调了实验组细胞KDR和eNOS的mRNA表达水平。
　　 结论：阿托伐他汀增加密度梯度离心法所获得的外周血内皮祖细胞数量的同时增强了内皮祖细胞的黏附和迁移能力；阿托伐他汀上调了EPCs相关蛋白的mRNA表达水平，可能在促进人工血管内皮化中起作用。
　　 总之，我们的实验结果显示阿托伐他汀可以增加外周血EPCs的数目和活性，加速人工血管内皮化进程，改善小口径人工血管术后的通畅率。他汀类药物应用方便，疗效确实，是改善小口径人工血管临床应用的有效辅助方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

实验材料

第一部分阿托伐他汀对犬人工血管移植后内皮化进程的影响

引 言

实验方法

结 果

讨论

小 结

第二部分阿托伐他汀促进犬人工血管内皮化机制的初步探讨

引 言

实验方法

结果

讨论

小结

全文结论

参考文献

附 录

致 谢