PI3K/Akt/FoxO3a通路在文拉法辛保护皮质酮诱导PC12细胞损伤中的作用

摘要

研究背景：抑郁症(depression)是由各种原因引起的以抑郁为主要症状的一组心境障碍(mood disorders)或情感性障碍(affective disorders)，是临床最常见的精神疾患之一，其发病率仅次于精神分裂症，该病是一种情感性精神障碍，临床表现以显著而持久的心境低落为主，并有相应的思维和行为改变。如思维迟缓，言语动作减少等，并伴随有食欲降低、性欲减退、睡眠障碍等躯体症状。后果更为严重时约有15％的抑郁症患者有自杀倾向，抑郁症正在成为威胁人类健康的严重疾患。据世界卫生组织的最新资料显示，到了2020年，抑郁症将成为仅次于癌症的人类第二大杀手，而对于中国来说，抑郁症将成为中国疾病负担最重的第二大疾病。自伤、自残、自杀及扩大性自杀者中，75％～85％为患有抑郁症患者所为。可以说，目前抑郁症已成为中国三大公共卫生健康问题之一。对抑郁症机制的研究中抑郁症发病的单胺假说是目前为大多数人接受的一种理论，单胺假说的发现是最初是从药理学的研究中得到启示的。能提高中枢神经系统单胺类神经递质功能或提高它们在神经突触问隙的浓度的药物都有改善情绪治疗抑郁症状的作用。因此，专家认为，抑郁症的发生与突触内神经递质水平的降低有直接关系；但是随着更多临床研究发现，单胺学说不能解释抗抑郁药能在给药数小时后增加神经递质在突触间隙的浓度，但抗抑郁的疗效却在连续治疗2-4周才开始出现的现象。单胺假说已不足以解释临床研究中的疑问，因此，人们提出了其他一些假说。
　　 慢性抑郁症患者的MRI(Magnetic Resonance Imaging，磁共振成像，MRI)结果发现某些大脑区域倾向于比正常人的相应区域小；动物实验也表明抗抑郁药能够保护由于应激造成的海马体积缩小，海马体积的缩小极有可能是由于海马神经元的萎缩，研究发现，应激过程中糖皮质激素水平的升高是海马神经元损伤的主要原因，应激导致的HPA轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，下丘脑-垂体-肾上腺轴)紊使体内皮质醇水平的增加，导致海马神经元功能障碍和结构改变，甚至发生神经元变性和死亡，如抑郁症发生后兴奋性氨基酸谷氨酸堆积，导致神经元变性，引起海马神经元的凋亡和死亡，甚至出现大脑功能形态损害。而抗抑郁药很可能是通过增加生长和存活促进因子如BDNF(Brain-derived neurotrophic factor，脑源性神经生长因子)的表达而阻止或逆转海马神经元的萎缩和损伤来实现其治疗作用。研究发现抗抑郁药的慢性治疗可上调BDNF及其受体trkB(Tropomyosin-related receptor B，原肌球蛋白相关受体B)的表达从而加强海马神经元生成，促进神经元分枝并阻止萎缩。因此，抗抑郁药极有可能使通过保护神经元损伤，改善抑郁症患者脑区器质性病变，从而达到抗抑郁作用。因此，本课题主要从抗抑郁药的神经保护作用出发，探讨抗抑郁药可能的作用机制。
　　 研究发现抗抑郁药能够通过cAMP(cyclic adenosine monophosphate，环磷酸腺苷通路)、PI(phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇)信号转导系统以及各种生化物质影响PI3K/Akt(Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein kinase B 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B)通路，而FoxO(Forkhead box,sub-group“O”，FoxO转录因子)作为PI3K/Akt通路的下游转录因子，在调节细胞周期，增殖，存活以及氧化应激等方面起着重要的作用，因此，本课题以皮质酮诱导PC12细胞损伤模拟抑郁症细胞模型，观察抗抑郁药文拉法辛对抗由皮质酮诱导PC12细胞损伤的保护作用及PI3K/Akt/FoxO3a通路是否参与了文拉法辛的保护作用。
　　 研究目的：
　　 1、观察文拉法辛对皮质酮诱导的PC12细胞损伤的保护作用。
　　 2、观察文拉法辛保护皮质酮诱导PC12细胞损伤的可能信号通路。
　　 3、观察文拉法辛对皮质酮诱导的PC12细胞损伤过程中FoxO3a、Akt蛋白磷酸化表达的影响。
　　 4、观察文拉法辛保护作用是否是通过PI3K/Akt通路发挥作用的。
　　 5、观察皮质酮以及文拉法辛对FoxO3a的亚细胞定位的影响。
　　 研究方法:
　　 1、建立由皮质酮诱导的PC12细胞损伤模型，观察文拉法辛对细胞损伤模型的保护作用，分为正常组，模型组，文拉法辛给药组，采用MTT assay，Hoechst stain检测细胞存活率以及细胞状态；Western Blot检测FoxO3a、Akt等蛋白磷酸化水平。
　　 2、采用通路阻断剂预处理，观察皮质酮诱导的PC12细胞损伤模型以及文拉法辛对细胞损伤模型的保护作用是否有所改变，采用MTT assay，Hoechst stain检测细胞存活率以及细胞状态；Western Blot 检测FoxO3a、Akt等蛋白磷酸化水平。
　　 3、PC12细胞瞬时转染GFP-FoxO3a质粒，采用皮质酮以及文拉法辛进行处理，观察不同情况FoxO3a转录因子的亚细胞定位。
　　 研究结果:
　　 1.皮质酮能够剂量依赖性的诱导PC12细胞损伤，Hoechst33342荧光染色观察皮质酮对PC12细胞凋亡的影响，以细胞萎缩、核固缩、染色质凝聚、凋亡小体形成和荧光强度增强等作为凋亡细胞指征，与正常组相比，模型组细胞状态多见核染色质浓缩密集，边缘化，形成深染团块呈新月状或戒指状，位于核膜下，核破裂出芽形成凋亡小体等细胞凋亡及死亡细胞的形态学表现。MTT结果以及荧光染色结果显示，与模型组相比，文拉法辛给药组细胞明显逆转由皮质酮诱导的细胞损伤，凋亡以及坏死细胞明显减少。
　　 2.westem blot结果显示，皮质酮处理能够剂量和时间依赖性降低Akt、FoxO3a的磷酸化水平，文拉法辛给药后能够逆转这种作用，升高磷酸化水平，发挥促存活作用。
　　 3.采用各通路阻断剂预处理后，发现PI3K/Akt通路抑制剂能够逆转文拉法辛对皮质酮诱导PC12细胞损伤的保护作用，并且明显改变由皮质酮诱导的Akt、FoxO3a磷酸化水平的改变，而其他通路抑制剂变化不明显，说明文拉法辛对皮质酮诱导PC12细胞损伤的保护作用部分是通过PI3K/Akt通路发挥作用的。
　　 4.采用瞬时转染GFP-FoxO3a质粒，结果显示，皮质酮处理能够明显增加FoxO3a的核转位，说明磷酸化水平降低；文拉法辛给药后能够促进FoxO3a的胞浆转位，磷酸化水平增加，促凋亡作用被抑制从而发挥促存活结果。
　　 结论: PI3K/Akt/FoxO3a信号通路参与了文拉法辛对皮质酮诱导PC12细胞损伤的保护作用的过程。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

前言

第一章文拉法辛对皮质酮诱导PC12细胞损伤的保护作用及其可能机制

引言

材料与方法

结果

小结

第二章PI3K/Akt/FoxO3a通路在文拉法辛保护皮质醇诱导PC12细胞损伤中的作用

引言

材料与方法

结果

小结

讨论

结论与展望

结论

展望

参考文献

致谢