暹罗鳄(Crocodylus siamensis)抗菌活性物质的筛选及抗菌肽hepcidin基因的克隆表达

摘要

鳄鱼是一类古老的爬行动物，在物种进化中占据重要的地位，其抗菌肽等免疫相关因子的研究相对较少。本论文在认真分析国内外有关报道的基础上，以人工养殖的暹罗鳄为对象，以探寻新的抗菌肽为目标，应用蛋白质分离纯化技术、基因克隆及体外表达技术、结合生物信息学软件分析，主要取得了以下研究结果：
　　 (1)全面研究了暹罗鳄不同组织粗提物的抗菌活性，发现血液、肝脏和卵巢提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最强。暹罗鳄的新鲜血清可以抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长，56℃灭活30 min后活性降低或丧失。用乙酸提取法制备的暹罗鳄白细胞粗提物对金黄色葡萄球菌和尖孢镰刀菌具有明显的抗菌活性。扫描电镜结果显示，粗提物处理30 min后，金黄色葡萄球菌菌体表面变得粗糙，有明显的颗粒状附着物，细胞壁有内陷；处理60 min后，细胞严重萎缩、变形，附有大量胶块状物质。处理后的尖孢镰刀菌孢子形态由表面光滑的镰刀状变成了表面附有大量乳突状物质的球形。
　　 (2)通过蛋白质层析技术结合非变性酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(AU-PAGE)纯化了白细胞粗提物中的一种抗菌活性物质，经过Shotgun串联质谱分析，推测该活性物质是组蛋白H1样的蛋白或肽段，并将其命名为Cshistidin。
　　 (3)克隆了暹罗鳄hepcidin cDNA，其ORF编码一个99-aa的前肽原preprohepcidin。生物信息学分析结果表明：暹罗鳄preprohepcidin包含一个25-aa的信号肽，一个48-aa的prodomain和一个26-aa的成熟肽(命名为Cs-hepc)。Cs-hepc的分子量为2933.46 Da，理论等电点为8.53，构建的Cs-hepc三维结构呈现一个典型的β-sheet构象。分别从DNA水平和蛋白质水平上对暹罗鳄preprohepcidin进行了同源比对，构建了preprohepcidin的系统进化树，结果表明：相对于两栖类和鱼类，暹罗鳄preprohepcidin与哺乳类的亲缘关系更近。
　　 (4)运用Real-time PCR研究了暹罗鳄hepcidin在健康鳄鱼中的组织表达，结果表明：暹罗鳄hepcidin在肝脏、肌肉、心脏、肾脏、小肠、血液、脂肪、脾脏、性腺和肺中均有表达。其中肝脏表达量最高，其次是肌肉和心脏，肝脏表达量是肌肉表达量的八十多倍，是心脏表达量的三百多倍。肾脏中的表达量最低。
　　 (5)构建了暹罗鳄hepcidin基因的原核重组表达质粒pET-hepc。在E.coli表达系统中成功的诱导表达了融合蛋白Trx-hepc。用肠激酶酶切后，获得了与预期大小一致的目的产物，但是没有检测到明显的抗菌活性。
　　 (6)合成了完全为酵母偏爱密码子的编码暹罗鳄hepcidin的基因Cs-hepc-pp，成功构建了暹罗鳄hepcidin基因的三种真核表达重组质粒，分别用于表达单一的暹罗鳄hepcidin成熟肽Cshepc、带有组氨酸标签的Cshepc/6His、带有组氨酸标签和分子伴侣c-cmyc的融合蛋白Cshepc/c-cmyc+6His。用甲醇诱导的方法在毕赤酵母KM71中实现了目的产物的高效表达。活性分析表明：三种表达上清对四株细菌均有明显的抑菌效果，其中Cshepc的活性最强，Cshepc/6His次之，Cshepc/c-cmyc+6His最弱。表达产物对芽孢枯草杆菌(Bacillussubtilis)的抑菌活性最强，50μg/ml的Cshepc可以抑制85.7％的B.subtilis的生长，对水产病原菌温和气单胞菌(Aeromonas sobria)的活性较弱。用镍柱亲和层析法从表达上清中纯化了带有组氨酸标签的融合蛋白Cshepc/6His，为暹罗鳄hepcidin的高效制备奠定了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1脊椎动物抗菌肽的研究进展

1.1脊椎动物抗菌肽的分类

1.2脊椎动物抗菌肽的结构和性质

1.3脊椎动物抗菌肽的生物活性

1.4脊椎动物抗菌肽的作用机理

1.5脊椎动物抗菌肽的应用前景

2 Hepcidin的研究进展

2.1 Hepcidin的分子结构

2.2 Hepcidin的组织分布和诱导表达

2.3 Hepcidin的生物活性

2.4 Hepcidin的应用前景

3本论文研究背景、内容和意义

第1章 暹罗鳄(Crocodylus siamensis)抗菌活性物质的筛选和分离纯化

1.1材料

1.2方法

1.3结果与分析

1.3.1暹罗鳄不同组织粗提取的抗菌活性测定

1.3.2暹罗鳄血清的抑菌活性

1.3.3白细胞粗提物的抗菌活性

1.3.4暹罗鳄白细胞粗提物对金黄色葡萄球菌和尖孢镰刀菌活性的电镜观察

1.3.5白细胞抗菌组分的分离纯化

1.3.6 AU-PAGE法分析暹罗鳄白细胞粗提物活性组分

1.3.7 RP-HPLC分析暹罗鳄白细胞粗提物抗菌组分

1.3.8 Cs-HPLC的质谱分析

1.4讨论

1.4.1组织抗菌活性物质的制备

1.4.2从白细胞中分离纯化抗菌肽

1.4.3组蛋白衍生的抗菌肽

1.5小结

第2章 暹罗鳄hepcidin基因的克隆分析和组织表达

2.1材料

2.2方法

2.3结果与分析

2.3.1暹罗鳄肝脏总RNA的提取

2.3.2暹罗鳄hepcidin基因片段的克隆及序列分析

2.3.3 Cs-hepc三维结构的构建

2.3.4 preprohepcidin基因的系统进化关系

2.3.5 Cs-hepc的组织表达

2.4讨论

2.4.1 Hepcidin的序列分析

2.4.2 Hepcidin的组织分布

2.5小结

第3章 暹罗鳄hepcidin基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中的原核表达

3.1材料

3.2方法

3.3结果与分析

3.3.1原核表达重组质粒pET-hep的构建

3.3.2融合蛋白的诱导表达

3.3.3融合蛋白的可溶性分析

3.3.4融合蛋白的纯化

3.3.5融合蛋白的酶切及目的蛋白的纯化

3.3.6重组蛋白的抗菌活性

3.4讨论

3.4.1小分子肽在大肠杆菌中的异源表达

3.4.2 Hepcidin的抗菌活性分析

3.5小结

第4章 暹罗鳄hepcidin基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及活性测定

4.1材料

4.2方法

4.3结果与分析

4.3.1暹罗鳄hepcidin的扩增和序列测定

4.3.2重组表达质粒的构建

4.3.3重组表达质粒的鉴定

4.3.4毕赤酵母重组子的获得

4.3.5重组子的甲醇诱导表达

4.3.6表达上清的抗菌活性

4.3.7 Cshepc／6His的纯化及HPLC分析

4.4讨论

4.4.1Htepcidin的真核表达

4.4.2Hepcidin真核表达产物的活性分析

4.5小结

全文结论与展望

参考文献

附录

后记