缺失型Splt-P49抗细胞凋亡活性的研究

摘要

Ac-P35是第一个被发现的杆状病毒抗细胞凋亡蛋白，能抑制许多生物，如线虫、昆虫和哺乳动物的细胞凋亡。Caspase是一类半胱氨酸类蛋白酶，是细胞凋亡的主要执行者。P35是caspase底物，能与caspase形成稳定的caspase-P35复合物，抑制caspase蛋白酶活性。在一些杆状病毒中发现的P49蛋白是一个分子量较大的P35同源物，其三维结构和作用模式与P35相似。通过序列比对发现相对于P35，在Splt-P49中间插入了一段长130个氨基酸左右的片段。在本研究中，通过引物重叠PCR技术，针对该序列，先后构建了编码Splt-p49但缺失了136个氨基酸的Splt-△P49-303的DNA序列和缺失了77个氨基酸的Splt-△P49-362的DNA序列。利用Bac-to-Bac技术，分别将这两段序列转座入已构建的缺失了Ac-p35的病毒vAcP35-KO的多角体蛋白基因座位中，得到重组病毒vAcP35-KO-△P49-303-PH-GFP和vAcP35-KO-△P49-362-PH-GFP，以研究Splt-△P49-303和Splt-△P49-362在AcMNPV的受纳细胞Sf9中的抗细胞凋亡活性。光学显微镜观察和凋亡染色实验结果显示，重组后的Splt-△P49-303和Splt-△P49-362不能代替P35的抗细胞凋亡能力，同时也失去了P49的抗细胞凋亡的能力，表明P49相对于P35多出的一段氨基酸序列对于P49的抗细胞凋亡功能可能是必须的；为研究p35和p49的起源与进化关系，对p35同源基因进行了初步的生物信息学分析。

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论文说明:缩略词

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第一章研究背景和目的

1.1杆状病毒和细胞凋亡

1.2杆状病毒凋亡抑制蛋白

1.3 Ac-P35抑制细胞凋亡的作用机制

1.4 Splt-P49和Ac-P35的氨基酸序列比对

1.5本研究的目的

第二章构建Splt-△P49-303及Splt-△P49-362补回型重组AcMNPV

2.1 AcMNPV bacmid和杆状病毒基因功能的研究

2.2缺失型Splt-P49重组病毒的构建

2.3重组vAcP35-KO-△P49-303-PH-GFP和vAcP35-KO-△P49-362-PH-GFP的PCR检测

第三章缺失型Splt-P49在vAcP35-KO感染Sf9细胞中抗细胞凋亡活性的研究

3.1重组AcMNPV转染和感染H15细胞的光学显微镜观察

3.2 Western blot检测

3.3重组AcMNPV感染Sf9细胞的光学显微镜观察

3.4重组AcMNPV感染Sf9细胞的细胞存活率

3.5讨论

第四章Ac-p35同源基因分子进化研究

4.1 p35同源基因氨基酸序列比对分析

4.2 P35同源蛋白三级结构分析

4.3基于p35同源基因氨基酸序列的系统发育树

4.4讨论

第五章实验仪器、材料和方法

5.1主要仪器

5.2实验材料

5.2.1细胞、菌种、病毒及载体质粒

5.2.2主要试剂

5.2.3主要溶液的配制

5.3实验方法

5.3.1重组vAcP35-KO-△P49-303-PH-GFP和vAc-P35-KO-△P49-362-PH-GFP的构建方法

5.3.2昆虫细胞的离体培养

5.3.3转染

5.3.4病毒上清的收取及病毒滴度的测定

5.3.5昆虫细胞的感染及细胞样品的收集

5.3.6 △p49-303在p35缺失型AcMNPV感染Sf9细胞中的表达分析

5.3.7活细胞计数

5.3.8 Ac-P35同源蛋白序列的获取及系统发育树的构建

5.3.9 Ac-P35同源蛋白三级结构的模拟

第六章文献综述

6.1细胞凋亡的概念及其特征

6.2细胞凋亡的分子机制

6.2.1细胞凋亡途径

6.2.2细胞凋亡中的关键酶caspase

6.3杆状病毒诱导的细胞凋亡

6.4杆状病毒抗细胞凋亡基因

6.5分子进化

6.5.1分子进化的概念、特点和中性理论

6.5.2分子进化的各种模式

总结

参考文献

致谢