血红素氧合酶-1基因对高糖及波动性高糖诱导血管内皮细胞凋亡的影响

摘要

目的:
　　观察血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因对高糖和波动性高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡及凋亡相关基因bax、bcl-2表达的影响,为基因治疗糖尿病血管病变提供实验和理论依据。
　　方法:
　　1.体外培养未转染HUVECs及转染HO-1基因的HUVECs(转染HUVECs)。
　　2.应用逆转录聚合酶链反应( reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测转染HUVECs HO-1基因mRNA的表达。
　　3.以体外培养成功的未转染HUVECs及转染HUVECs为研究对象,研究HO-1基因对高糖和波动性高糖诱导的HUVECs凋亡及凋亡相关基因bax、bcl-2表达的影响。实验分6组:正常葡萄糖组(未转染HUVECs+含5.5mmol/L D-葡萄糖)、稳定性高糖组(未转染HUVECs+含20.0mmol/L D-葡萄糖)、波动性高糖组(未转染HUVECs+含每24小时轮换加入5.5mmol/L或20.0mmol/L D-葡萄糖)、正常葡萄糖/HO-1组(转染后HUVECs+含5.5mmol/L D-葡萄糖)、稳定性高糖/HO-1组(转染后HUVECs+含20.0mmol/L D-葡萄糖)与波动性高糖/HO-1组(转染后HUVECs+含每24小时轮换5.5mmol/L或20.0mmol/L D-葡萄糖)。各组细胞在37℃,5％CO2条件下培养7天。应用噻唑蓝(MTT)方法测定HUVECs细胞存活率;应用吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色法检测HUVECs细胞凋亡形态学改变;应用RT-PCR检测凋亡相关基因bax、bcl-2mRNA的表达。
　　结果:
　　1.HO-1基因mRNA在转染HUVECs的表达
　　RT-PCR检测结果显示:HO-1mRNA在未转染HUVECs的表达量很低,而在转染HUVECs的表达量显著升高(P<0.05)。
　　2.高糖和波动性高糖对HUVECs存活率的影响
　　HUVECs在高糖和波动性高糖环境培养7天后,采用MTT方法测定HUVECs存活率。检测结果显示:稳定性高糖组与波动性高糖组HUVECs存活率下降,分别为正常葡萄糖组的79%(P<0.05)和59%(P<0.001),且波动性高糖组HUVECs存活率低于稳定性高糖组(P<0.05)。
　　3.高糖和波动性高糖对HUVECs凋亡的影响
　　HUVECs在高糖和波动性高糖环境培养7天后,AO/EB染色检测结果显示:稳定性高糖组与波动性高糖组HUVECs凋亡细胞数明显上升,分别为正常葡萄糖组的1.61倍(P<0.001)和1.79倍(P<0.001),且波动性高糖组HUVECs凋亡细胞数高于稳定性高糖组(P<0.05)。
　　4.高糖和波动性高糖对凋亡基因bax、bcl-2mRNA表达的影响
　　HUVECs在高糖和波动性高糖环境培养7天后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测bax、bcl-2 mRNA表达。检测结果显示:与正常葡萄糖组相比,稳定性高糖组与波动性高糖组bcl-2mRNA表达显著减弱(P<0.05,P<0.001),且波动性高糖组bcl-2mRNA的表达较高糖组减弱更为显著(P<0.05)。baxmRNA的表达无明显变化,差异没有统计学意义(P>0.05)。
　　5.HO-1基因对HUVECs存活率的影响
　　转染HUVECs与未转染HUVECs在高糖和波动性波动性高糖环境培养7天后,MTT方法测定HUVECs存活率。检测结果显示:与稳定性高糖组和波动性高糖组相比,稳定性高糖/HO-1组与波动性高糖/HO-1组HUVECs存活率升高。稳定性高糖/HO-1组为稳定性高糖组的1.37倍(P<0.05);波动性高糖/HO-1组为波动性高糖组的1.47倍(P<0.05)。
　　6.HO-1基因对高糖和波动性高糖诱导的HUVECs凋亡的作用
　　转染HUVECs与未转染HUVECs在高糖和波动性高糖环境培养7天后,AO/EB染色检测结果显示:与稳定性高糖组和波动性高糖组相比,稳定性高糖/HO-1组与波动性高糖/HO-1组 HUVECs凋亡细胞数明显下降,稳定性高糖/HO-1组为稳定性高糖组的67%(P<0.001);波动性高糖/HO-1组为波动性高糖组的81%(P<0.001)。
　　7. HO-1基因对凋亡基因bax、bcl-2mRNA表达的影响
　　转染HUVECs与未转染HUVECs在高糖和波动性高糖环境培养7天后,提取细胞总RNA, RT-PCR检测bax、bcl-2mRNA表达。结果显示:与稳定性高糖组与波动性高糖组相比,稳定性高糖/HO-1组、波动性高糖/HO-1组bcl-2mRNA表达增强(P<0.05)。baxmRNA表达无明显变化(P>0.05)。
　　结论:
　　1.高糖和波动性高糖均能诱导血管内皮细胞凋亡,且波动性高糖比稳定性高糖诱导的血管内皮细胞凋亡程度更为严重,其机制可能与抗凋亡基因bcl-2的表达减少有关。
　　2. HO-1基因的表达上调可以减轻高糖和波动性高糖引起的血管内皮细胞凋亡,从而对细胞发挥保护作用。
　　3. HO-1基因可能通过直接或间接上调抗凋亡基因bcl-2表达而减轻高糖和波动性高糖诱导的血管内皮细胞凋亡。

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目录

第1章 前言

第2章 实验材料与仪器设备

2.1实验材料：

2.2 仪器设备

第3章 实验方法

3.1 研究对象及实验分组

3.2 HUVECs的复苏、传代及冻存

3.3 RT-PCR检测转染HUVECsHO-1mRNA表达

3.4 噻唑蓝（MTT）法测定HUVECs存活率

3.5吖啶橙／溴乙啶(AO/EB)观察HUVECs凋亡形态学改变

3.6 RT-PCR检测HUVECs凋亡基因bax和bcl-2mRNA表达

3.7统计学处理

第4章 实验结果

4.1 体外成功培养未转染HUVECs和转染HUVECs

4.2 HUVECs HO-1基因mRNA的表达

4.3高糖和波动性高糖对HUVECs存活率的影响

4.4 高糖和波动性高糖对HUVECs凋亡的影响

4.5高糖和波动性高糖对凋亡基因bax、bcl-2mRNA表达的影响

4.6 HO-1基因对HUVECs存活率的影响

4.7 HO-1基因对高糖和波动性高糖诱导HUVECs凋亡的作用

4.8 HO-1基因对凋亡基因bax、bcl-2mRNA表达的影响

第5章 讨论

5 .1 高糖和波动性高糖诱导HUVECs凋亡

5.2 高糖和波动性高糖对凋亡相关基因bax、bcl-2表达的影响

5.3 HO-1基因对高糖和波动性高糖诱导的HUVECs凋亡的作用

5.4 HO-1基 对因 高糖条件下凋亡相关基因bax、bcl-2表达的影响

第6章 结论

参考文献

综述(一)

综述(二)

论文发表情况

致谢