尾加压素II促进大鼠血管外膜成纤维细胞表型转化和迁移作用及其细胞内机制研究

摘要

背景:尾加压素II(Urotensin II,UII)是由11个氨基酸残基组成的神经环肽,最早是从硬骨鱼脊髓尾部下垂体(urophysis)中分离出来,UII是迄今为止所发现的最强的一种血管活性肽,其收缩血管效应甚至超过ET-1。UII广泛存在于从软体动物到哺乳动物体内,其特异性受体为GPR14,亦称为UT,目前已经在人体内分离出这种受体。UII具有许多生理学效应,例如刺激人内皮细胞、平滑肌细胞和心肌成纤维细胞增殖,促进心肌成纤维细胞的I型、III型胶原蛋白和纤维连接蛋白的分泌,除此之外,UII还能促使新生大鼠心肌肥大。提示其在血管重塑中起到了重要的作用。然而 UII对血管外膜成纤维细胞( adventitial fibroblast, AF)表型转变和迁移的作用尚未阐明
　　目的:研究尾加压素II对大鼠血管外膜成纤维细胞表型转化、胶原分泌和迁移的影响及其信号转导机制。
　　方法:使用贴块法培养大鼠胸主动脉血管外膜成纤维细胞,使用尾加压素II和各种信号转导通路阻断剂来刺激血管外膜成纤维细胞,分别通过蛋白免疫印迹试验(Western blotting),酶联免疫吸附试验(ELISA),细胞迁移试验(transwell technique)来测定血管外膜成纤维细胞中α-平滑肌激动蛋白(α-SM-Actin)的表达,I型胶原蛋白的分泌和细胞迁移。
　　结果:UII以时间和浓度依赖的方式刺激血管外膜成纤维细胞表达α-SM-Actin,采用10-8M分别刺激成纤维细胞4、16、和24小时后,细胞α-SM-Actin表达随刺激时间延长而逐渐增加,分别较对照组高22.45％、52.25%和100.56%(P<0.01)。此外,UII尚可以浓度依赖方式刺激α-SM-Actin表达,10-10、10-9、10-8、10-7和10-6M UII组分别较对照组高12.6%(P>0.05),31.73%(P<0.05),79.00%(P<0.01),65.31%(P<0.01)和59.26%(P<0.01)。UII能够被促有丝分裂蛋白激酶(MAPK)阻断剂PD98059、钙调神经磷酸酶阻断剂CSA、Rho激酶阻断剂Y227632、PKC阻断剂H7以及钙通道阻断剂Nicardipine所抑制。结果还发现,UII能够以浓度依赖性方式促进I型胶原蛋白分泌。其中10-10M UII组刺激作用不明显(P>0.05),10-9、10-8、10-7-6和10 M UII组分泌量明显增加,分别较对照组高32.11%(P<0.01)、41.04%(P<0.01)、42.60%(P<0.01)、35.19%(P<0.01)。该作用同样能够被促有丝分裂蛋白激酶(MAPK)阻断剂PD98059、钙调神经磷酸酶阻断剂CSA、Rho激酶阻断剂Y227632、PKC阻断剂H7以及钙通道阻断剂Nicardipine所抑制,其中H-7抑制作用最为明显(P<0.01)。10-10M组刺激迁移作用并不明显,但随着UⅡ浓度增加, UⅡ促进细胞迁移的作用明显增强,呈浓度依赖性,在10-8 M时作用达到高峰( P<0.01)。而10-7 M和10-6 M UⅡ组效应虽然明显高于对照组(均为P<0.01),却低于10-8 M组。10-9 M、10-8-7-6M、10 M和10 M UⅡ组迁移分别较对照组增加2.5、4.7、2.9和3.1倍。UⅡ的作用能够被促有丝分裂蛋白激酶阻断剂PD98059、钙调神经磷酸酶阻断剂CSA、Rho激酶阻断剂Y227632以及PKC阻断剂H7所抑制,抑制率分别为41.9%、77.4%、65.4%和78.6%( P<0.01)。然而,尽管钙通道阻断剂nicardipine组细胞迁移较UⅡ组减少15%,但无统计学意义( P>0.05)。
　　结论:本研究发现UII能够以浓度方式促进血管外膜成纤维细胞表达α-SM-Actin,向肌成纤维细胞表形转化,并促进成纤维细胞分泌I型胶原。这些作用可以通过促有丝分裂蛋白激酶MAPK、钙调神经磷酸酶、Rho以及PKC,钙通道等途径来实现。同时UⅡ也是是一种新的促进血管外膜成纤维细胞迁移的活性因子,该作用可通过PKC、促有丝分裂蛋白激酶、钙调神经磷酸酶、Rho激酶途径来实现,但其中钙离子通道的作用尚待进一步阐明。

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1 前言

2 材料与方法

2.1试剂、仪器与设备

2.1.1主要试剂

2.1.2主要仪器与设备

2.1.3主要试剂的配制

2.2试验方法

2.2.1试验动物

2.2.2细胞培养

2.2.3试验分组

2.2.4免疫印迹（Western Blotting）[29]

2.2.5酶联免疫吸附试验（ELISA）

2.2.6细胞迁移试验（Transwell）

2.3数据处理及分析

3 结果

4 讨论

参考文献

附录一 综述

附录2：英文缩略词

附录三 AFs元代培养图片

附录四 研究生期间发表的论文

附录五 个人简历

致谢