绿茶及其提取物与抗生素合用抗MRSA的作用及机制研究

摘要

目的：⑴了解来自汕头和北京地区的67株MRSA的耐药情况及耐药机制，并分析耐药表型与基因型的一致情况。⑵筛选绿茶抗MRSA的主要成分，观察绿茶和提取物与抗生素的协同抗菌情况，并进一步探讨绿茶浸出物对MRSA的抗菌机制。⑶测定Ecg/EGCg与β-内酰胺类抗生素对MRSA的协同抗菌作用，并研究Ecg/EGCg与β-内酰胺类抗生素对MRSA的协同抗菌作用机制。⑷研究Ecg与四环素对MRSA的协同抗菌作用并探讨其机制。
　　 方法：①以琼脂稀释法测定24种抗菌药物对MRSA的体外抗菌活性，PCR扩增MRSA的耐药基因，nitrocefin测定细菌产β-内酰胺酶的情况。②分别测定绿茶、青茶、白茶、红茶和黑茶对MRSA的MIC，并比较它们对MRSA的抗菌效果；测定茶叶的主要成分茶多酚、茶多糖、茶皂素、茶色素和咖啡因对MRSA的MIC，推测绿茶抗MRSA的主要成分。用纸片扩散法测定绿茶浸出物及其提取物与抗生素抗MRSA的协同作用。以渗透试验检测MRSA 对绿茶的蒸馏水和NaCl 溶液的耐受情况。HPLC 测定绿茶及其提取物对头孢唑啉在金葡菌菌体内蓄积量的影响。③以微量稀释法测定Ecg、EGCg和β-内酰胺类抗生素的体外协同抗MRSA作用。以RT-PCR技术检测Ecg、EGCg对lytM、lgrA基因表达的影响，并监测细菌自溶酶活性的变化。WB法测定EGCg 对MRSA的PBP2a 蛋白的影响。用超声破碎法提取β-内酰胺酶，测定Ecg和EGCg对β-内酰胺酶的抑制情况，并与三唑巴坦的抑酶作用进行比较。④以微量稀释法测定Ecg与四环素的体外抗MRSA协同作用。用PCR技术筛选tetK基因阳性株和阴性株，以荧光法测定Ecg/EGCg 对tetK外排泵的抑制作用。
　　 结果：⑴67株MRSA除了对氯霉素和多西环素的耐药率较低，分别为3％和7.5％，对万古霉素、米诺环素和利凡诺100％敏感外，对利福平的耐药率为52.2％，对四环素的耐药率为77.6％，而对于其它包括青霉素、第1-4代头孢菌素、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类、氨基糖苷类和磺胺类的耐药率均在80～90％以上，氨苄西林加酶抑制剂以后则耐药程度有所降低。qacA/B 、mecA、tetM、NorA、gyrA、aac (6’)/aph(2”)、aph (3’) III和β-lactamase检出率分别为11.9％、95.5％、70.1％、4.5％、10.4％、82.1％、73.1％ 和92.5％ ，未检出qacC 、ant (6) - Ⅰ、ant (2″)-Ⅰ、VanA和VanB耐药基因。67株MRSA均携带有多种耐药基因：同时携带2种耐药基因的有7株，3种的有10株，4种的有11株，5种的29株，6种的10株。⑵绿茶浸出物对MRSA的MIC范围为0.125％～0.5％；青茶浸出物为0.125％～0.5％；白茶浸出物为0.0625％～0.25％；红茶浸出物为0.5％；黑茶浸出物为0.25～0.5％。茶多酚为128～256μg/ml；茶色素为256～512μg/ml；茶多糖为512～1024μg/ml；茶皂素和咖啡因的MIC 均大于1024μg/ml。绿茶浸出物对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、头孢他啶、头孢替唑、米诺环素和四环素的抗MRSA 作用有增效作用，与红霉素和氯霉素呈无关作用，与环丙沙星呈拮抗作用。茶多糖、茶皂素、茶色素、咖啡因与苯唑西林抗MRSA呈无关作用。茶多酚、Ecg和EGCg与苯唑西林抗MRSA有增效作用。EC与苯唑西林抗MRSA呈无关作用。EC有进一步加强Ecg 对苯唑西林的抗MRSA作用。绿茶浸出物促进MRSA在蒸馏水和NaCl溶液中的破坏。经过绿茶浸出液、茶多酚、EC、Ecg和EGCg预处理的金葡菌体内蓄积的头孢唑啉明显增多。⑶50μg/ml 的Ecg/EGCg均能增强苯唑西林、头孢拉定、头孢呋辛、美罗培南对MRSA的抗菌作用，其中与美罗培南的协同效果比苯唑西林、头孢拉啶和头孢呋辛明显。在同等浓度下，Ecg与β-内酰胺类抗生素的协同效果比EGCg明显。随着Ecg和EGCg浓度的增高，MRSA的lytM、lgrA基因表达上调。而且EGCg浓度增加可导致产生的自溶酶增多。25、50和100μg/ml EGCg可使MRSA-2的PBP2a蛋白表达下调。三唑巴坦对金葡菌β-内酰胺酶有很强的抑制作用，浓度为256μg/ml时可完全抑制金葡菌的β-内酰胺酶，而EGCg/Ecg对金葡菌β-内酰胺酶的抑制作用很微弱，浓度为409.6μg/ml的时，金葡菌β-内酰胺酶仍能使nitrocefin变色。⑷Ecg对MRSA和ATCC25923的MIC均为256μg/ml；四环素对MRSA的MIC值为2～128μg/ml，对ATCC25923为2μg/ml。合用25μg/ml的Ecg与四环素后，15株MRSA中有5株呈协同作用，7株呈相加作用，2株呈无关作用，1株呈拮抗作用。ATCC25923 呈相加作用。经Ecg处理四环素释放曲线低于未经Ecg 处理的曲线。
　　 结论：①67株MRSA耐药情况严重，并同时携带多种耐药基因。②五种茶叶对MRSA均有一定的抗菌作用，抗菌较强的是白茶和绿茶。绿茶浸出物能增强β-内酰胺类抗生素和四环素对MRSA的抗菌作用。绿茶抗MRSA主要成分为茶多酚，而且只有茶多酚才能增强苯唑西林对MRSA的抗菌作用。进一步筛选发现，茶多酚中的两个单体Ecg EGCg能增强苯唑西林对MRSA的抗菌作用。而EC能进一步加强Ecg与苯唑西林对MRSA协同抗菌作用。通过绿茶的蒸馏水和NaCl溶液渗透试验，我们推断绿茶浸出物抗MRSA的机制可能与破坏细菌细胞壁有关。绿茶浸出物、茶多酚、EC、Ecg 和EGCg均能促进头孢唑啉在MRSA和ATCC菌体内蓄积。③Ecg/EGCg与β-内酰胺类抗生素对金葡菌的协同抗菌机制是由于Ecg/EGCg作用于细胞膜，阻断细胞膜蛋白如PBP1，PBP3，PBP2a 等的生成或抑制其活性，从而抑制细菌细胞壁的合成，并促进抗生素在菌体内蓄积，同时导致细菌自身发生自溶反应，但抑制β-内酰胺酶的作用很弱。④Ecg与四环素对金葡菌主要呈协同或相加作用。其机制可能为抑制金葡菌的四环素外排泵。