AMPK激活剂调节p21CIP、p27KIP、cyclinD1诱导肝癌细胞株HepG2细胞周期停滞

摘要

背景及目的：
　　腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是细胞能量调节的感受器。研究资料表明,AMPK激活剂二甲双胍及AICAR可对多种肿瘤细胞产生增殖抑制作用,其功能与AMPK对细胞周期调控作用密切相关。目前有关AMPK激活剂对肝癌细胞增殖抑制、细胞周期影响的报道较少,未见详细机制的报道。本研究将通过AMPK激活剂二甲双胍及AICAR对肝癌细胞株HepG2的增殖抑制、细胞周期影响及其作用机制的研究,为AMPK成为抗肿瘤治疗的新靶点提供新的理论依据。
　　材料和方法：
　　1.用含10％胎牛血清,100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基培养人肝癌细胞株HepG2细胞。
　　2.用含不同浓度二甲双胍(2.5、5.0、10、20mM),AICAR(50、100、250、500μM)的培养基分别处理HepG2细胞24、48、72h,以未予药物处理细胞为对照,噻唑蓝比色法(MTT法)检测二甲双胍及AICAR对HepG2细胞增殖的影响。
　　3. HepG2细胞用含10mM的二甲双胍的培养基和500μM的AICAR的培养基作用72h,经碘化丙啶(PI)单染法,用流式细胞分析仪(FCM)检测HepG2细胞周期情况。
　　4.用含10mM的二甲双胍培养基和500μM的AICAR的培养基作用HepG2细胞24h, Western Blot检测AMPK磷酸化程度、以及G1/S调节点细胞周期调节蛋白p21CIP、p27KIP、cyclin D1、CDC2、CDK2表达量。
　　5. HepG2细胞用含10mM的二甲双胍的培养基和500μM的 AICAR的培养基作用24h,DAPI染色后荧光显微镜下观察HepG2细胞凋亡情况。
　　结果：
　　1. Western blot结果显示,经二甲双胍及AICAR处理后,HepG2细胞AMPK磷酸化程度较对照组增强。
　　2. MTT法检测结果显示,与对照组比较,二甲双胍及AICAR能抑制HepG2细胞的生长,并且呈浓度和时间依赖性。
　　3.流式细胞术检测结果显示,HepG2细胞经二甲双胍及AICAR处理24h后,细胞周期发生G0-G1期停滞,G0-G1期百分比和对照组相比较,差别具有统计学意义。
　　4. Western Blot结果显示,经二甲双胍及AICAR处理后,HepG2细胞p21CIP和p27KIP表达较对照组增强,cyclin D1表达较对照组减弱, CDK2、CDC2表达与对照组比较无明显变化。
　　5. DAPI染色观察可见,HepG2细胞经二甲双胍及AICAR处理24h后,镜下可见部分细胞核碎裂,细胞发生凋亡。
　　结论：
　　1. AMPK激活剂诱导HepG2细胞增殖抑制。
　　2. AMPK激活剂诱导HepG2细胞发生G0-G1期细胞周期停滞。
　　3. AMPK激活剂磷酸化激活HepG2细胞AMPK,上调p21CIP、p27KIP表达量,下调cyclinD1表达量,CDC2、CDK2表达量无明显变化。
　　4. AMPK激活剂诱导HepG2细胞凋亡。
　　综上所述,AMPK激活剂通过磷酸化激活AMPK,上调p21CIP、p27KIP表达,下调cyclinD1表达,抑制G1/S检查点,诱导肝癌细胞发生G0-G1期细胞周期停滞。

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第一章 前言

第二章 材料和方法

2.1 实验仪器和设备

2.2 主要试剂

2.3 细胞株

2.4 实验相关试剂及配制

2.5 实验器械的处理

2.6 实验方法

第三章 实验结果

3.1 二甲双胍及AICAR对HepG2细胞AMPK磷酸化程度的影响

3.2 二甲双胍及AICAR对HepG2细胞增殖抑制作用

3.3 二甲双胍及AICAR诱导HepG2细胞周期停滞

3.4 二甲双胍对HepG2细胞p21CIP、p27KIP、cyclin D1、CDC2、CDK2蛋白表达影响

3.5 二甲双胍及AICAR诱导HepG2细胞凋亡

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述

参考文献

致谢

个人简历