乙肝病毒X蛋白经p53非依赖途径抑制依托泊苷诱导的Hep3B细胞凋亡

摘要

背景和目的:肝癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一,而乙型肝炎病毒慢性感染是导致原发性肝细胞癌发生的重要原因之一。我国属HBV感染高流行区,超过半数的肝癌患者存在乙型肝炎病毒感染。HBV是一种基因组很小的DNA病毒,其编码的X蛋白具有多种生物学功能,特别是对凋亡的影响与肝癌的发生有着密切的关系。以往的一些研究结果显示在与HBV感染相关的肝细胞癌中发现HBx能与p53蛋白结合,发挥其生物学作用,p53是一个重要的肿瘤抑制基因,其介导的细胞信号传导通路途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用,但是肝癌病人的p53表达通常都是异常和失活的,因此探讨HBx在p53缺失的肝癌细胞系Hep3B上对凋亡的影响将作为本研究的关注点。
　　方法:将Hep3B接种于6孔板中,第二天用质粒pHBx-EGFP和pEGFP瞬时转染细胞,转染后48h用100μM的Etoposide诱导凋亡,3h后收获细胞,先用DAPI染色观察核固缩现象,再运用流式细胞术分析细胞周期的变化,并进一步通过RT-qPCR和Western blot的方法发现凋亡相关基因的变化。
　　结果:经Etoposide诱导的Hep3B-HBx-EGFP及Hep3B-EGFP细胞都有核固缩现象和凋亡的sub-G1期峰,但Hep3B-HBx—EGFP中细胞凋亡的比例低于Hep3B-EGFP细胞,RT-qPCR检测发现与转染空载质粒pEGFP组相比,转染质粒pHBx-EGFP组的Bcl-2mRNA的表达明显增加,而caspase3、caspase8和caspase9及BaxmRNA的表达明显减少;Western blot检测发现与转染pEGFP组相比,转染pHBx-EGFP组的caspase3蛋白的活化明显降低(p<0.01)。
　　结论:HBx能抑制Hep3B细胞的凋亡,这种抑制是通过上调Bcl-2的表达并下调caspase和Bax,减少caspase3的活化实现的。同时也表明,即使是在无p53存在的情况下,HBx能影响肝癌的发生与发展,而这种影响发生的机制有待更进一步研究。

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第一章 前言

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

第三章 结果

3.1 HBx在Hep3B细胞中的表达

3.2 DAPI染色观察细胞凋亡

3.3 流式细胞术检测细胞周期

3.4 凋亡相关基因mRNA表达的变化

3.5 凋亡过程中caspase 3蛋白的活化

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

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