基于柯萨奇B3反向遗传系统的病毒示踪及CXCL10重组疫苗的研究

摘要

柯萨奇B3(Coxsackievirus B3,CVB3)属于小核糖核酸病毒科(Picornavirus),肠道病毒属(Enterovirus)B型,为无包膜的单股正链小RNA病毒。CVB3主要通过粪-口途径传播,是引起病毒性心肌炎最常见的致病原,也可引起手足口病。2008年我国部分地区暴发了以肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)为主要致病原的手足口病流行,但最近几年CVA16,CVB3感染呈上升趋势。尽管目前在CVB3的分子结构,病理及诊断方面取得了很大的进展,但临床上仍没有针对CVB3感染的特效药物和疫苗。本研究建立了CVB3反向遗传系统。在此基础上,构建了表达CXCL10的减毒疫苗,用于预防CVB3感染及感染后引起的病毒性心肌炎。本课题主要从事了以下三个方面的研究,研究内容及结果如下:
　　1.建立重组CVB3反向遗传系统。本研究利用反向遗传学技术克隆了CVB3全基因组,并构建了重组CVB3感染性克隆质粒。将质粒转染后COS-7细胞后,通过病毒引起细胞病变效应、空斑实验、细胞免疫荧光实验以及western blotting,证实我们成功获得重组CVB3(rCV);rCV可以在Vero细胞上稳定传代;rCV形成的病毒空斑小于CVB3野生型(CVB3-WT)。我们通过测序分析,序列比对明确了CVB3的遗传学背景以及rCV与CVB3-WT的基因组差异:共有20处碱基差异其中3个位于5’-NTR区,11个位于P1区,5个位于P2区以及1个3’-NTR区。这些碱基的差异导致11处氨基酸改变,其中P1区有8个氨基酸差异,这可能会引起病毒壳蛋白的构象改变,导致病毒与细胞表面受体结合能力相比CVB3-WT下降,因而形成的蚀斑较小。
　　2.构建重组CVB3表达载体(rCV-CS)和GFP标记的重组CVB3(rCV-GFP)。为了构建重组CVB3表达载体用于疫苗研究,本研究在重组CVB3感染性克隆基础上,进行了改造:我们将CVB3病毒2A蛋白酶识别序列和多克隆位点插入rCV的P1区和P2区之间构建了rCV-CS。为明确rCV-CS能否用于表达外源蛋白,同时也为了建立可示踪CVB3,本研究将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入rCV-CS的多克隆位点,建立了GFP标记的重组CVB3(rCV-GFP)。通过体内外感染实验,证实rCV-CS可用于稳定的表达外源蛋白。可视化的rCV-GFP为研究活细胞或活体CVB3感染与宿主细胞以及感染动物后病毒的组织嗜性方面提供更直观,便捷研究的方法。
　　3.建立表达CXCL10的重组CVB3减毒疫苗。在上述研究平台的基础上,我们在国内外首次建立了表达趋化细胞因子CXCL10(IP-10)的重组CVB3(rCV-IP)。体外细胞实验和小鼠感染实验显示rCV-IP能有效的表达mIP-10,组织器官病毒载量及病理切片提示rCV-IP安全无致病性。通过小鼠免疫及攻毒实验,本研究以下三个指标评价rCV-IP是否产生有效的保护力:(1)小鼠的一般行为活动,体重变化,以及感染后的症状;(2)组织器官病毒载量;(3)组织器官病理变化。结果显示:未免疫组小鼠在受到CVB3感染后10天内出现明显体重下降,竖毛倦缩,活动减少以及四肢疱疹样感染症状,而rCV-IP免疫组小鼠在高剂量CVB3攻击后,未见上述感染症状。组织器官病毒载量及病理切片结果证实rCV-IP能有效保护小鼠免受CVB3再次感染,及感染后引起的组织器官免疫病理反应。证明了表达趋化细胞因子CXCL10(IP-10)的rCV-IP能有效预防CVB3的感染及感染后的免疫病理损伤。
　　综上所述,本研究结果表明重组CVB3作为表达载体,用于病毒示踪研究以及表达细胞趋化因子的重组病毒活疫苗用于预防CVB3感染切实可行。本研究有望为CVB3的防控提供新思路和有效预防策略。

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绪论

1. 柯萨奇病毒的发现与分类

2. CVB3基因组结构和功能

3. CVB3的致病性

4. 肠道病毒的疫苗研究

5. 本课题研究的目的和意义

6. 本研究的总体技术路线图

第1章 建立CVB3反向遗传系统

1.引言

2.材料与方法

3.实验结果

4.讨论

5.小结

第2章 GFP示踪重组CVB3的构建与鉴定

1.引言

2.材料与方法

3.实验结果

4.讨论

5.小结

第3章 表达CXCL10的重组CVB3预防病毒性心肌炎

1.引言

2.材料与方法

3.实验结果

4.讨论

5.小结

结论

参考文献

致谢

发表论文情况

Induction of cytopathic effect and cytokines in coxsackievirus B3-infected murine astrocytes

References

Influenza Virus and CNS Infections

REFERENCES

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