二甲双胍(Metformin)诱导人急性早幼粒白血病HL-60细胞死亡的机制研究

摘要

【背景及目的】
　　背景：二甲双胍(Metformin；1-1二甲基双胍)，分子式C4H11N5，是现今作为治疗2型糖尿病首推的一线药物，二甲双胍主要是通过提高胰岛素的敏感性，增加外周葡萄糖的利用，抑制肝、肾过度的糖原异生及延缓葡萄糖在胃肠道的吸收从而降低血糖。除了治疗糖尿病之外，二甲双胍还常规用于治疗多囊卵巢综合征，并具有改善非酒精性脂肪肝的症状，预防治疗葡萄膜炎及降低帕金森患病率等作用。有研究显示服用二甲双胍的糖尿病病人其患癌症的风险率也下降了，于是近年来逐渐形成了研究二甲双胍的一股热潮，特别是二甲双胍如何抑制肿瘤细胞的生长增殖及其具体的作用机制，对于不同的肿瘤细胞其抗肿瘤的具体机制也不尽相同。本实验以人早幼粒细胞白血病HL-60细胞株作为研究对象，观察其对HL-60细胞的增殖抑制作用及其引起HL-60细胞凋亡的机制。
　　目的：1.研究二甲双胍抑制HL-60细胞增殖的机制；
　　2.研究活性氧族ROS在二甲双胍诱导HL-60凋亡中所起的作用。
　　【材料和方法】
　　用含10％超级新生牛血清的RPMI1640培养基体外培养人早幼粒白血病HL-60细胞，待细胞生长融合至80%，用相应的抑制剂或激活剂(Compound C, NAC, Z-DEVD-FMK, Nicotinamide, Rapamycin)预处理细胞，用含不同浓度的二甲双胍(0 mM,2.5 mM，5 mM,10 mM,20 mM)的培养基处理细胞24小时或者含有10 mM二甲双胍的培养基处理细胞0 h,6 h,12 h,24 h,48 h后，倒置相差显微镜观察HL-60细胞的形态学变化；MTT方法检测细胞的存活率；DAPI染色观察细胞核变化分析细胞凋亡；caspase-3还原酶试剂盒检测细胞酶活力变化情况，SOD gel分析MnSOD活性变化， Western Blot检测相关蛋白的表达量以及在免疫荧光检测相关蛋白在细胞中的亚定位；全波长荧光酶标仪测定相关的荧光值变化(钙离子浓度变化，线粒体膜电位，活性氧族等)；流式细胞术PI单染法检测细胞周期以及Annexin v-FITC PI双染法检测凋亡细胞所占比例。
　　【结果】
　　1. MTT法检测显示随着二甲双胍药物浓度增加以及时间的延长，细胞逐渐死亡，活细胞数逐渐减少。
　　2. DAPI染色及Western Blot技术检测等实验显示当0-20 mM二甲双胍处理24 h及0-48 h10 mM二甲双胍作用HL-60细胞时，有明显凋亡现象出现,且该现象与二甲双胍的剂量和作用时间成依赖性关系，caspase-3酶活性的检测结果显示caspase-3酶活性增强。并且加入caspase-3抑制剂后，caspase-3酶活性及蛋白均有所下降
　　3.流式细胞术检测细胞周期PI单染法检测细胞结果显示细胞周期被阻滞在G0-G1期，双染法及Annexin v-FITC-PI染色显示细胞凋亡随着二甲双胍浓度的增加及时间的延长逐渐增加。Western Blot技术检测G0/G1期相关蛋白p21及cyclin D1的表达情况，发现随着二甲双胍浓度及时间的增加，p21及cyclin D1表达逐渐上升。
　　4.全波长酶标仪显示线粒体膜电位逐渐下降，Western Blotting检测凋亡相关通路的蛋白及自噬标志性蛋白LC3II/I表达，随着二甲双胍作用浓度增加和作用时间增长，cleaved caspase-3逐渐增加而pro caspase-3逐渐减少，Bax/Bcl-2比值上升，线粒体细胞色素c逐渐减少，胞浆细胞色素c逐渐增加。细胞外凋亡通路FAS逐渐增加，Bid逐渐转变为tBid。LC3II/I变化不明显。
　　5. SOD Gel检测MnSOD活性随着二甲双胍浓度的增加及时间的延长逐渐增加。全波长荧光酶标仪结果显示随着二甲双胍浓度的增加及时间的延长细胞内钙离子逐渐增加， H2O2逐渐增加，O2-逐渐减少。
　　5. Western Blotting检测MAPK通路家族蛋白变化，p-P38, p-JNK随着二甲双胍浓度的增加及时间的延长表达量逐渐增加，p-ERK逐渐下降。p-c-fos, p–c-jun，c-fos及c-jun均逐渐增加。
　　6.全波长酶标仪检测钙离子浓度变化，发现其随着二甲双胍浓度及时间的增加逐渐增多，Western Blotting检测AMPK相关通路家族蛋白的变化，p-LKB1，p-AMPK逐渐上升， p-P70S6K逐渐下降，且AMPK抑制剂Compound C明显的逆转了二甲双胍引起的AMPK通路的激活，且可提高细胞存活率，同时p-ERK上调，caspase-3酶活性及蛋白剪切体均下调.
　　7. ROS抑制剂NAC及metformin共同作用HL-60细胞后与单独加入metformin相比可见H2O2的含量变化不明显细胞生存率显著上升，caspase-3酶活性及蛋白均下调. Western blotting检测了NAC作用后p-AMPK，p-ERK，p-P70S6K表达，结果显示p-AMPK，p-ERK表达上升而p-P70S6K表达下降。
　　【结论】
　　1.二甲双胍在一定浓度、时间范围内能抑制体外培养的人急性早幼粒白血病HL-60细胞的生长和增殖，其机制与p-AMPK, p-ERK及p-70S6K的激活相关，从而促进细胞进一步死亡。
　　2.二甲双胍能够诱导HL-60细胞发生线粒体凋亡及死亡受体凋亡通路，并且在此实验范围内并不引起细胞发生自噬。其激活细胞凋亡与细胞内产生的ROS的产生有关，ROS引起细胞内AMPK及MAPK通路相关蛋白的改变从而促进细胞凋亡。

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目录

第一章 前言

第二章 实验材料

2.1细胞株

2.2主要试剂

2.3主要仪器和设备

第三章 实验方法

3.1细胞培养

3.2细胞形态观察

3.3 DAPI细胞核荧光染色

3.4 MTT法检测细胞增殖活性

3.5流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡

3.6全波长酶标仪检测ROS的变化、钙离子及线粒体膜电的变化

3.7 Caspase-3活性检测

3.8 Western Blot检测蛋白变化情况

3.9 SOD-Gel

3.10 线粒体，胞浆蛋白提取

3.11 数据分析

第四章 实验结果

4.1 MTT法检测二甲双胍对HL-60细胞生长的抑制作用

4.2 MET对HL-60细胞caspase-3活性的影响

4.3 流式细胞术检测metformin处理HL-60细胞后凋亡情况

4.4 MET诱导HL-60细胞死亡并未通过自噬

4.5 MET诱导HL-60细胞凋亡经过线粒体凋亡通路

4.6 MET诱导HL-60细胞凋亡经过死亡受体通路

4.7 MET诱导HL-60细胞周期阻滞在G0/G1

4.8 ROS参与MET诱导的HL-60细胞凋亡

4.9 AMPK 通路参与MET诱导的HL-60细胞凋亡

4.10 MAPK通路参与MET诱导的HL-60细胞凋亡

4.11 ROS参与二甲双胍诱导的MAPK及AMPK相关通路的变化

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

附录

致谢

个人简历

研究生期间论文发表情况