PAK4通过上调突变型p53蛋白的表达降低乳腺癌对多柔比星的敏感性

摘要

背景与目的：乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一，也是女性癌症患者的第二大死因，其发病率逐年增高，且日益年轻化，已成为中国妇女疾病负担最重的恶性肿瘤之一。化疗在乳腺癌综合治疗中的占据着重要的地位，其中蒽环类药物作为乳腺癌的一线化疗方案选择药物，在临床治疗上得到广泛应用。但是不同的患者对其敏感性有显著地个体差异，不同患者的疗效不甚相同，甚至有一部分患者产生耐药，它们并不能从蒽环类化疗方案中明显获益。近年来，随着肿瘤分子生物学和对基因功能的深入研究，人们逐渐认识到，暴露于化疗制剂后决定肿瘤细胞命运的主要是基因型而不是制剂的基因毒性，肿瘤细胞相关基因的表达水平是造成对同一化疗药物敏感性不同的主要原因[1]。因此，探寻乳腺癌化疗的疗效预测因子，明确其耐药机制可能成为解决乳腺癌化疗耐药问题的关键。近来大量研究表明p21-活化激酶4（p21-activated kinase4,PAK4）过表达于人类多种肿瘤组织中[2]，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用[3]。而且越来越多的文献报道，PAK4与化疗耐药有显著的相关性[4]。PAK4可以降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[5]，但具体机制仍有待进一步完善。p53是肿瘤抑制基因，但约50％的肿瘤会发生 p53突变[6]。突变型 P53（mutant-type P53,mtP53）不仅能导致肿瘤的发生发展[7]，而且与肿瘤对化疗的敏感性有密切的关系[8]。有研究报道，在多柔比星等细胞毒性药物引起的细胞死亡中，P53起着关键作用[9]。存在mtP53的细胞比存在野生型P53(wild-type P53,wtP53)更容易产生对包括蒽环类在内的多药耐药[10]。P53突变是细胞株对致细胞DNA损伤药物产生耐药的最主要原因[11]。我们的前期研究发现，在乳腺癌细胞系中，PAK4蛋白的表达与P53一致。在乳腺癌中，PAK4与mtP53是否存在调控关系，目前的研究尚不清楚，相关研究有待进一步完善。明确 PAK4与mtP53的关系，可能能够为乳腺癌的治疗，特别是逆转化疗耐药，提供一个新的治疗靶点。
　　材料和方法：本实验通过在MDA-MB-231细胞中建立过表达和干扰PAK4的细胞株，采用细胞增殖实验来研究PAK4对乳腺癌细胞增殖的影响；采用药物敏感性实验来研究PAK4对乳腺癌细胞化疗敏感性的影响；采用Western Blot及实时荧光定量PCR进一步探索PAK4影响乳腺癌细胞生物学行为的机制；利用免疫组织化学方法检测乳腺癌组织中PAK4与mtP53的表达情况。应用SPSS17.0软件进行数据统计分析，采用卡方检验分析PAK4与mtP53表达在乳腺癌中的相关性。P≤0.05为差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1.细胞增殖实验及平板克隆形成实验结果显示，过表达PAK4后，MDA-MB-231细胞的增殖能力明显上升；而干扰PAK4后乳腺癌细胞增殖能力明显下降。
　　2.药物敏感性实验中，过表达PAK4后，MDA-MB-231细胞对多柔比星的敏感性明显降低；而干扰PAK4后，MDA-MB-231细胞对多柔比星的敏感性明显升高。
　　3.Western Blot结果显示，过表达PAK4后，p-ATM（Ser1981）、p-Chk2(Thr68)、p-P53(Ser15)及 mtP53蛋白含量增加；干扰 PAK4后， p-ATM（Ser1981）、p-Chk2(Thr68)、p-P53(Ser15)及mtP53蛋白含量降低。而总ATM蛋白含量一直不变。
　　4. RT-PCR结果显示，无论是上调还是下调PAK4mRNA水平后，mtP53在mRNA水平均无明显变化。
　　5. PAK4主要定位于乳腺癌细胞浆，而P53主要定位于乳腺癌细胞核。PAK4与mtP53的表达在乳腺癌中呈现正相关关系。
　　结论：在MDA-MB-231乳腺癌细胞中，PAK4可以在转录后水平正调控mtP53蛋白的表达，从而降低乳腺癌细胞对多柔比星的化疗敏感性。

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第一章 前言

第二章 实验材料

2.1主要仪器

2.2 细胞及实验动物

2.3 主要试剂

2.4 溶液的配制

第三章 实验方法

3.1质粒的转化和提取

3.2建立稳定干扰或高表达PAK4的MDA-MB-231细胞株

3.3Western Blot实验

3.4 RT-PCR实验

3.5 细胞相关实验

3. 6 免疫组化实验

第四章 结果

4.1 PAK4及mtP53在乳腺癌细胞系中的表达有着一致性

4.2 MDA-MB-231细胞中瞬时过表达PAK4能上调mtP53蛋白的表达

4.3 PAK4能在转录后水平正调控mtP53蛋白的表达

4.4 PAK4可以促进乳腺癌细胞的增殖

4.5 PAK4可以降低MDA-MB-231乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性

4.6乳腺癌组织标本中分析胞浆PAK4与mtP53表达的相关性

第五章 讨论

第六章 结论

主要的结果

问题与展望

参考文献

综述

致谢

论文发表情况

本人简历