体外诱导人脐带间充质干细胞分化的神经样细胞表达细胞红蛋白及血管内皮生长因子的情况

摘要

背景目的：新生儿缺氧缺血性脑病是围产期缺氧导致的缺氧缺血性脑损害，是新生儿期致残、致死的重要原因，其发病机制复杂，预后差，目前临床上缺乏有效的治疗措施，患儿可遗留不同程度的神经、精神系统后遗症。细胞疗法是近年来备受关注的以干细胞为核心的治疗方法，脐带间充质干细胞来源广泛，取材方便，几乎没有伦理问题，并且具有低免疫源特性、无肿瘤恶变性的特点，使其在与其他类型间充质干细胞的比较上具有优越性。脐带间充质干细胞能分泌一系列具有神经保护功能的蛋白，为新生儿缺氧缺血性脑病的治疗提供了一个切入点。细胞红蛋白是2001年发现的第四个携氧球蛋白家族成员，具有可逆性结合、运输和储存氧的功能，在缺氧时表达水平升高，能清除氧化应激导致的过量的NO、ROS等自由基，具有抗氧化和抗凋亡作用，推测能够在脑缺氧缺血性应激时发挥神经保护功能，这就为新生儿缺氧缺血性脑病的治疗提供了又一个切入点。目前，采用“脐带间充质干细胞”和“细胞红蛋白”作为关键词在Pubmed上进行检索，未发现有相关文献发表。本实验通过western blot 方法检测CYGB和VEGF在人脐带间充质干细胞上的表达情况，并且在体外诱导人脐带间充质干细胞向神经样细胞分化，比较诱导前后CYGB和VEGF表达水平的变化，为“诱导脐带间充质干细胞向神经样细胞分化治疗缺氧缺血性脑损伤的机制研究”提供基础。
　　方法：将培养至第4代的人脐带间充质干细胞随机分成4组：对照组（脐带间充质干细胞组）、Neural Basal + B27 组、β-巯基乙醇诱导组（BME 组）和丹参组。采用免疫组织化学方法检测各组细胞的神经细胞标记蛋白Nestin和NSE的表达情况；并使用western blot 检测各组细胞表达CYGB和VEGF的蛋白水平；然后通过统计学方法分析诱导前后CYGB和VEGF表达水平的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果：1.免疫组织化学染色提示，使用β-巯基乙醇或者丹参诱导后，人脐带间充质干细胞出现神经样细胞的形态学改变，且表达 Nestin和NSE 明显增强。
　　2.Western blot结果提示，各组均能检测到CYGB、VEGF和内参GAPDH表达的条带，说明脐带间充质干细胞和诱导后的神经样细胞均能够表达CYGB和VEGF。
　　3.Western blot条带灰度值分析提示，使用β-巯基乙醇或者丹参诱导后，CYGB的表达水平比对照组升高，差异有显著统计学意义（P<0.01），且β-巯基乙醇诱导组比丹参诱导组的CYGB水平升高更明显，差异有显著统计学意义（P<0.01）；使用β-巯基乙醇或者丹参诱导后，VEGF的表达水平较对照组下降，差异有显著统计学意义（P<0.01）。Spearman相关性分析提示，CYGB与VEGF表达水平呈负相关（(r=-0.888], P<0.01)，即在同一个组内，CYGB表达水平越高，VEGF表达水平越低。
　　结论：1.β-巯基乙醇和丹参均能在体外诱导脐带间充质干细胞分化为神经样细胞。
　　2. 脐带间充质干细胞能在转录水平上表达 CYGB。
　　3. β-巯基乙醇和丹参诱导后，CYGB的表达水平明显升高，且β-巯基乙醇诱导组比丹参诱导组 CYGB 表达水平升高更明显。
　　4. β-巯基乙醇和丹参诱导后，VEGF的表达水平明显下降。
　　5. 各组 CYGB和VEGF 表达水平呈负相关，即 CYGB 水平越高，VEGF表达水平越低。
　　6. 脐带间充质干细胞的神经保护作用可能是通过 CYGB 介导的。

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第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第3章 实验结果

3.1 人脐带华通胶来源间充质干细胞的培养、传代和诱导

3.2 各组神经细胞标记Nestin和NSE的表达情况

3.3 各组CYGB和VEGF的表达情况

第4章 讨论

4.1 人脐带间充质干细胞能在体外被诱导分化为神经样细胞

4.2 脐带间充质干细胞能表达CYGB

4.3 脐带间充质干细胞表达VEGF

4.4 脐带间充质干细胞能表达 CYGB 在治疗新生儿缺氧缺血性脑病方面的意义

第5章 结论

参考文献

致谢

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