慢性ITP患者血小板钙相关蛋白、载脂蛋白A、凋亡相关蛋白和活性氧簇的观察

摘要

特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是一种临床常见的出血性疾病，约占出血性疾病总数的30％。其临床特点是无明显外源性病因的血小板数量减少，从而出现出血症状，尤其以皮肤粘膜出血为主，严重者可有其它部位出血如鼻出血、牙龈渗血、妇女月经量过多或呕血、咯血、便血和尿血等症状，颅内出血是本病的致死病因。根据年龄、疾病持续时间以及能否自行缓解，临床上将ITP分为急性和慢性两型，前者多见于儿童，部分患者具有自限性；后者多出现于成人，女性多见，很少能自行缓解（自行缓解率≤5%），部分病例表现为间歇性发作与缓解交替，很难治愈。临床上，急性ITP患者经过肾上腺糖皮质激素、静脉应用大剂量丙种球蛋白、促血小板生成药物以及免疫抑制剂等方法治疗后，大多数患者均能痊愈，治疗效果比较理想。而慢性ITP患者上述措施治疗后，患者的血小板计数有所上升，但在药物减量或者停药以后，患者的血小板计数再次下降，导致病情复发，很难彻底治愈。鉴于慢性ITP的治疗效果确实不令人满意，所以研究慢性ITP的病理生理学发病机制就显得极为重要。虽然国内外普遍认为慢性ITP的发病机制主要与免疫反应有关，巨核细胞增殖发育成熟障碍和血小板生成障碍在慢性ITP的发病过程中也起着重要作用。但其详细的病理生理学机制尚未完全阐明。鉴于慢性ITP的治疗效果确实不令人满意，所以研究慢性ITP的病理生理学发病机制就显得极为重要。在本论文中采用流式细胞术观察了慢性ITP患者血小板内Ca2+、钙连蛋白（calnexin，CNX）、钙网蛋白（calreticulin，CRT）、载脂蛋白A-II（apolipoprotein-II，ApoA-II）、载脂蛋白A-IV（apolipoprotein-IV，ApoA-IV）、凋亡相关蛋白以及活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的变化，为揭示慢性ITP的病理生理学机制提供参考，也为临床防治慢性ITP的新疗法提供理论依据。
　　【目的】
　　分析慢性ITP患者血小板内Ca2+、CNX、CRT、ApoA-II、ApoA-IV、凋亡相关蛋白以及ROS的表达情况，探讨慢性ITP的病理生理学机制。
　　【方法】
　　2013年3月至2015年3月在汕头大学医学院第二附属医院血液科门诊和住院的20例慢性ITP患者，年龄20～55岁（平均年龄35.8岁），其中男性5例，女性15例。所有患者均根据《成人特发性血小板减少性紫癜诊断治疗专家共识》的诊断标准确诊，病程均在1年以上。体检健康志愿者（健康对照）20例，年龄20～55岁（平均年龄32.5岁），其中男性5例，女性15例，均为汕头大学医学院第二附属医院体检中心体检健康人员。
　　分别采集上述20例慢性ITP患者和20例健康对照者的外周血，提取血小板。采用流式细胞术检测血小板内Ca2+、CNX、CRT、ApoA-II、ApoA-IV、凋亡相关蛋白以及ROS的表达情况。
　　【结果】
　　1.血小板内Ca2+、CNX和CRT的表达
　　流式细胞学检测显示，慢性ITP患者表达Ca2+的血小板百分率为(74.19?19.40)%，显著高于健康对照者[(22.79?10.47)%]（P<0.05）；慢性ITP患者表达CNX的血小板百分率为(15.10?7.32)%，显著低于健康对照者[(41.79?14.45)%]（P<0.01）；慢性ITP患者表达CRT的血小板百分率为(25.11?12.66)%，亦显著低于健康对照者[(38.58?12.02)%]（P<0.05）。
　　2.血小板内ApoA-II和ApoA-IV的表达
　　流式细胞学检测显示，慢性ITP患者表达ApoA-II的血小板百分率为(46.60?12.60)%，显著高于健康对照者[(18.40?10.24)%]（P<0.05）；慢性ITP患者表达ApoA-IV的血小板百分率为(43.43?15.10)%，也显著高于健康对照者[(16.49?10.13)%]（P<0.01）。
　　3.血小板内凋亡相关蛋白的表达
　　流式细胞学检测显示，慢性 ITP患者表达 p38-MAPKs的血小板百分率为(61.66?19.38)%，显著高于健康对照者[(27.52?14.34)%]（P<0.05）；慢性ITP患者表达Egr-1的血小板百分率为(62.22?20.48)%，也显著高于健康对照者[(9.05?5.79)%]（P<0.05）；慢性ITP患者表达p53的血小板百分率为(56.82?20.07)%，显著多于健康对照者[(4.35?2.04)%]（P<0.05）。慢性 ITP患者表达 Bcl-xL的血小板百分率为(5.38?1.52)%，显著低于健康对照者[(21.20?6.04)%]（P<0.05）；慢性ITP患者表达Bak的血小板百分率为(39.86?11.45)%，显著高于健康对照者[(20.82?11.85)%]（P<0.05）；慢性ITP患者表达Bax的血小板百分率为(36.85?15.99)%，也显著高于健康对照者[(6.69?5.01)%]（P<0.05）。
　　4.血小板内ROS的表达
　　慢性ITP患者表达ROS的血小板百分率为(19.41?13.32)%，显著高于健康对照者[(1.16?0.85)%]（P<0.05）。
　　【结论】
　　慢性ITP患者血小板内的Ca2+、ApoA-II、ApoA-IV、p38-MAPKs、Egr-1、p53蛋白，Bcl相关蛋白Bak和Bax以及ROS的表达均增多，而CRT、CNX和Bcl-xL等的表达均减少。我们推测，血小板内上述这些蛋白相互之间可能存在着一个网络，通过这个网络调控慢性ITP的发生和发展。然而，这些差异蛋白调控慢性ITP发生和发展的详细信号转导机制目前尚不清楚，还有待于进一步研究。

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引言

第一部分 慢性ITP患者血小板Ca2+及其相关蛋白的检测

前言

材料和方法

实验结果

第二部分 慢性ITP患者血小板内载脂蛋白A的检测

前言

材料和方法

实验结果

第三部分 慢性ITP患者血小板内凋亡相关蛋白的检测

前言

材料和方法

实验结果

第四部分 慢性ITP患者血小板内ROS的检测

前言

材料和方法

实验结果

第五部分 讨论

1. 血小板内钙相关蛋白的探讨

2. 血小板内ApoA的探讨

3. 血小板内相关凋亡蛋白的探讨

4. 血小板内ROS的探讨

5. 血小板内相关蛋白关系的探讨

结论

参考文献

综述:线粒体介导细胞凋亡的研究进展

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