尸体肝组织推断死亡时间的生物化学和生物力学的研究

摘要

目的和意义：
　　推断死亡时间(Postmortem Interval,PMI)是法医鉴定首要任务之一。迄今仍没有公认准确的实际方法，有效推断PMI方法研究已成为法医学的历史性难题和挑战。肝脏为腹腔内体积质量均最大的相对独立的特别是组织结构较均一的实质性内脏器官，含有丰富的蛋白质、脂类、碳水化合物和核酸生物大分子。肝组织死后变化不仅表现在形态学方面，更是基于自身生化物质的改变，为各类方法检测提供了广泛的选择性。气相色谱-质谱联用技术（Gas chromatography-Mass spectrometry，GC-MS)利用色谱分离和质谱鉴定,具有极高分辨率和灵敏度，可通过参考和比较的标准谱图库，进行相关物质的代谢组学溯源，可对小分子有机物进行快速的定性和准确的定量分析，筛选到对推断PMI具有重要价值的小分子代谢物。基于本课题组前期的肝组织形态学和生物力学推断PMI研究中，发现尸体组织的自溶腐败过程，本质上属于蛋白质、脂类和碳水化合物、核酸生物大分子物质单向性降解或水解，产生氨基酸、碱基、脂肪酸等结构性小分子物质的过程，本研究利用GC-MS法，通过内标相对定量检测不同温度条件下，肝组织氨基酸类等物质死后的时序性变化规律及其与推断PMI相关方程。同时，综合前期的生物力学、量化病理组织学等相关PMI指标，探讨利用综合性推断PMI的可行性和最佳方案。
　　材料与方法：
　　屠宰场放血处死的健康成年家猪全肝组织，置于15℃、25℃、30℃恒温及75％恒湿的人工智能气候箱中，在0h-120h间每隔12h为一时间点取材，8个样本/时间点。
　　1、GC-MS检测：各时间点取材剔掉肝被膜、避开血管，取0.1g肝实质组织，80%乙醇溶液1:10固定72h，500μL的0.1mol/L酸化、匀浆、离心，取上清液400μL，乙腈去蛋白后上清50μL，20μL内标正亮氨酸，混匀吹干；50μL的MTBSFA和50μL吡啶、微波中火衍生化2分钟；静置1h，1μL进样，安捷伦气相色谱质谱仪自带GC/MS数据分析工作站进行定量分析，标记各氨基酸，计算峰面积，以各氨基酸峰面积除以内标峰面积计算各氨基酸相对含量。
　　2、形态学及生物力学：均取25℃恒温75%恒湿条件下，各时间点标准化拍照装置拍照并观察肝组织大体形态变化，“六定”规范化取材，选肝右侧叶较厚区域，剔除被膜后，沿长轴切取组织大小约2.5×2.0×2.0cm3检材，2个×8组检材，分别4%甲醛和80%酒精按体积比（组织与固定液)1:10比例固定72h后，修整成1.5×1.0×1.0cm3长方体标准样件，便携式生物力学检测仪(KDI-0.2)纵轴单向压缩，记录生物力学参数。同时，另肝组织4%甲醛常规固定，制作石蜡肝组织切片，分别HE、Masson特殊染色，Image-Pro Plus6.0量化分析，计算空隙总面积、胶原纤维总面积及总IOD。大体照片利用Photoshop CS5软件计算三原色（RGB）值。
　　统计分析：
　　采用Simca-P13.0进行多维统计分析，包括主成分分析（Principal Component Analysis，PCA)、偏最小二乘法（Partial Least Square，PLS)，观察整体变化趋势及代谢轮廓。采用SPSS进行单因素方差分析Bonferroni法两两比较均值、简单线性回归（Linear Regression，LR)、逐步多元线性回归（Stepwise Multiple Linear Regression,SMLR)，P＜0.05为显著性差异，推导多种代谢物和多指标推测PMI线性拟合公式。用GraphPad Prism5统计图标软件制图。
　　结果：
　　1、固定前肝组织R、G、B值均呈时序性下降，分别R、G、B均值(Y)与PMI（X)简单线性回归分析，R色值的相关性最好，各组间比较P＜0.05：YR=-0.572X+131.722（R2=0.741)。
　　2、肝组织形态学分析，间隙总面积呈时序性增加趋势，染色胶原纤维总面积及总IOD时序性下降，组织间隙总面积与PMI相关性较好，各组间比较P＜0.05：Y间隙总面积=12233.81X+23794.57，R2=0.745。
　　3、4%甲醛和80%乙醇固定肝组织的各生物力学参数均随PMI呈下降趋势，甲醛固定组的PMI相关性优于乙醇，其中最大力与PMI相关性最好指标。甲醛固定组Y最大力=-0.901X+109.06（R2=0.915)，乙醇固定Y最大力=-0.685X+70.77（R2=0.814)。
　　4、80%乙醇固定猪肝组织GC-MS检测，各温度组氨基酸含量随PMI呈整体增加趋势：
　　⑴25℃组氨基酸含量与PMI的PCA：模型R2X=0.834，Q2=0.69，所测的全部氨基酸在72h内区分较好，与PMI呈明显线性增高趋势的“窗口期”为24-84h，0-24h呈前“平台期”，84h后呈“波动性”，提示25℃环境温度下肝组织最佳推断PMI为死后72h之内。PLS分析：R2X=0.815，R2Y=0.815，Q2=0.911，其中VIP＞1的成分，即对模型贡献大的成分与0-120h内线性较好的氨基酸基本一致，回归方程分别为：Y丙氨酸=0.026x-0.034（R2=0.873)，Y亮氨酸=0.035X-0.335（R2=0.886)，Y缬氨酸=0.019X-0.177(R2=0.86)，Y异亮氨酸=0.016X-0.148（R2=0.808)；Y苯丙氨酸=0.007X-0.081（R2=0.710)；Y甘氨酸=0.011X+0.204（R2=0.688)；Y甲硫氨酸=0.002X-0.014（R2=0.681)。各氨基酸综合多元线逐步回归方程：YPMI=11.456X亮氨酸+13.605X丙氨酸+14.162X甘氨酸+6.110（R2=0.922，P＜0.001，模型F=604.266，SE=10.629)。
　　⑵30℃组氨基酸含量与PMI的PCA：R2X=0.981，Q2=0.857，各氨基酸在60h较集中，可以较好的分离，与PMI呈明显线性增高趋势的“窗口期”为12-72h，0-12h呈前“平台期”，84h后呈“波动性”，提示30℃环境温度下肝组织最佳推断PMI为死后72h之内。PLS分析:R2X=0.815，R2Y=0.815，Q2=0.911，其中VIP＞1的成分，即对模型贡献大的成分，与0-120h内线性较好的氨基酸基本一致，回归方程分别为Y丙氨酸=0.037X+(R2=0.895)；Y缬氨酸=0.029X-0.12(R2=0.893)；Y亮氨酸=0.046X+0.242（R2=0.812)；Y异亮氨酸=0.022X-0.018（R2=0.887)；Y甘氨酸=0.016X+0.221（R2=0.787)；Y苯丙氨酸=0.005X+0.024(R2=0.701)。各氨基酸综合多元线性逐步回归分析方程: YPMI=13.632X丙氨酸+19.051X异亮氨酸+4.471（R2=0.920，P＜0.001，模型F=310.985，SE=10.629)。
　　⑶15℃组0-168h内，各氨基酸随PMI变化不明显。综合3个温度组所有时间点氨基酸含量的PCA，3个主成分模型：R2X=0.847，Q2=0.703，三个温度组0-24h存在交叉，24h后各温度组散点分布较集中，且相互分离，说明不同温度组的氨基酸相对含量存在显著性差异，综合比较温度升高，同一时间点的氨基酸相对含量也高，氨基酸生成速率25℃时约为15℃的3-5倍左右，30℃约为25℃的1.2-1.5倍左右。
　　5、综合25℃/湿度75%组0-120h肝组织GC-MS检测的氨基酸相对含量值、生物力学参数指标、形态学量化指标，与PMI多元逐步线性回归分析得最优模型的回归方程：YPMI=8.848X亮氨酸-0.331X最大力-0.509X平均力-0.24X弹性模量+8.396×10-6 X间隙总面积(R2=0.975；P＜0.001，模型F=318.559，SE=5.282)。
　　结论：
　　1、GC-MS检测80%酒精固定的肝组织，氨基酸相对含量时序性变化，可做为一项死后72h内推断PMI新的思路，预测误差10h左右，具有较好的应用前景。
　　2、温度作为影响推断PMI的重要因素，环境温度明显加快肝组织0-120h内生成氨基酸的速率，30℃约为25℃的1.2-1.5倍，25℃时约为15℃的3-5倍左右。
　　3、尸体肝组织的自溶腐败过程，构成组织生物力学性状变化的生物化学物质变化的基础，即物质代谢-组织结构-力学指标之间具有内在本构关系和构效关系的关联规律，多方法联合检测，预测误差在5h左右，可明显提高PMI的科学性和准确性。
　　4、常规甲醛固定的肝组织更适合生物力学性状参数研究，乙醇固定液的肝组织更适合作为尸体化学/生物化学研究。

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缩略语释义表

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前言

第一部分 家猪肝组织气相色谱-质谱联用（GC-MS)法检测肝组织氨基酸含量推断死亡时间

引言

第一章 材料与方法

1.1 材料

1.2实验方法

第二章 结果

2.1衍生化方法学考察结果

2.2标准曲线结果

2.3 精密度结果

2.4 重复性结果

2.5氨基酸检测结果

2.6 25℃组猪肝GC-MS检测氨基酸含量

2.7 30℃组猪肝GC-MS检测氨基酸含量

2.8 15℃组猪肝GC-MS检测氨基酸含量

2.9不同温度组猪肝GC-MS检测氨基酸含量

第三章 讨论

3.1标本处理和提取方法

3.2氨基酸与尸体化学

3.3 氨基酸与死亡时间的关系

3.4温度与氨基酸时序性变化的关系

第二部分 家猪肝组织4%甲醛和80%乙醇固定生物力学及形态量化推断死亡时间

引言

第一章 材料与方法

1.1实验材料

1.2试验方法

1.3 数据处理

第二章 结果

2.1 家猪肝组织大体改变

2.2 家猪肝组织各时间点RGB值变化

2.3 家猪肝组织生物力学指标检测

2.4肝组织光学观察及病理图像量化分析

2.5肝组织GC-MS、生物力学及形态学指标综合分析

第三章 讨论

3.1 肝组织生物力学与PMI关系

3.2家猪肝组织形态量化指标改变与PMI关系及与生物力学联合分析

3.3肝组织GC-MS检测、生物力学与形态学综合分析与PMI关系

结论

参考文献

附图

文献综述: 肝脏推断死亡时间的方法研究进展

个人简介

致谢