尸体脑组织降解代谢组学变化及其推断死亡时间的研究

摘要

目的和意义：
　　准确地推断死亡时间(Postmortem Interval，PMI)一直是法医学鉴定难题，也是一项历史性的重要研究课题。本实验利用代谢组学、生物力学和形态学的理论和技术，探讨在不同温度情况下，家猪脑组织随 PMI的时序性变化规律。
　　材料与方法：
　　屠宰场放血处死的成年家猪(约4个月龄，体重120~150 kg)，提取大脑组织，置于恒温恒湿人工气候箱内自然腐败。气候箱温度设置75％RH，温度设置3个处理组(15℃、25℃、30℃)，分别于0 h~96 h、0 h~84 h、0 h~72 h每隔6 h按“六定”标准化规范取材，备制脑组织匀浆液，进行80%乙醇固定萃取-甲醇二次提取脑组织匀浆，以正亮氨基酸为内标，MTBSTFA衍生化后 GC-MS检测，定性定量检测各物质峰。同时25℃组观察记录并标准化拍照装置拍照各PMI脑组织大体形态变化，利用Photoshop CS6软件计算RGB、R、G和B值；脑组织以4%甲醛固定，备制生物力学检测试件和常规制作脑组织石蜡切片，试件行生物力学纵轴单压缩检测，切片分别 HE、Glees神经纤维染色，进行量化病理学分析，计算脑白质空白间隙 RE及 IOD。
　　所有结果以均数±标准差表示，采用SIMCA13.0.3、SPSS20.0、GraphPad Prism5等软件进行统计分析，包括PCA、PLS/OPLS-DA、散点图、线性回归和Kruskal-Wallis检验等。
　　结果：
　　1、方法学考察
　　改良微波辅助衍生化方法筛选最佳的反应条件，反应媒介为吡啶，于微波低火条件下衍生化反应2 min。考察仪器精密度、线性、重复性和稳定性等，大部分物质的 RSD均在允许范围内(<15%)。
　　2、GC-MS检测
　　(1)对各温度组的可分辨峰进行主成分分析以了解各个温度组代谢物质的降解规律和趋势，得分散点图结果示：除15℃组各时间组区分不明显外，25℃和30℃组前后平台期和窗口期的时间点可彼此分开，且30℃组变化比25℃组快1个时间点(即6 h)。3个温度组总的得分散点图表明3个温度组大部分时间点可相互区分开，部分交叉点的时间为各温度组前平台期。
　　(2)对各温度组的可鉴定物质峰进行 PLS模型建立，得分散点图结果示：不同温度组存在不同的时间区分组，与 PCA结果相仿。3个温度的排列试验图均表明模型是可接受的，Y Perdicted Plot的回归曲线分别为：Y15℃=0.9999X+0.2716(R2=0.8759)、Y25℃=1.0003X+0.3163(R2=0.9273)和Y30℃=0.9989X+0.4899(R2=0.9552)。各温度组VIP值法和Kruskal-Wallis检验筛选出重要的生物标志物质数分别为11、18和15。以PMI为Y变量，温度和各代谢物质的相对定量为 X变量，建立 OPLS-DA模型的得分散点图可明显区分3个温度组，而且，30℃组的大部分物质的平均生成速率是15℃组的3.5~24倍；25℃组的大部分物质的平均生成速率是15℃组的2.5~14倍。
　　(3)线性回归分析：各温度组的大部分物质的含量随 PMI变化，回归模型和参数检验均有统计学意义，决定系数和估计标准误大小与 PLS回归模型的 VIP值大小顺序相当。各温度组的逐步多元回归方程分别为：15℃组 YPMI=2.241+22.51X琥珀酸+161.7X缬氨酸+125.3X5-氨基缬草酸(R2=0.840、SE=11.60)；25℃组 YPMI=6.610+16.29X十八烷酸+14.56X5-氨基缬草酸+5.517X丙氨酸(R2=0.909、SE=6.323)或 YPMI=15.78+9.690 X5-氨基缬草酸+86.45X亮氨酸–82.35X甘氨酸（R2=0.952、SE=4.271)；30℃组 YPMI=7.187+7.405 X琥珀酸+12.27X5-氨基缬草酸+6.798 X缬氨酸(R2=0.896、SE=6.611)。
　　3、生物力学和形态学变化
　　(1)大体形态和RGB值变化：随着 PMI延长，脑组织从表面湿润光滑、血管纹理清晰，逐渐到灰暗无光泽、血管模糊，直至消失；从略有弹性、质较软、有形，逐渐到瘫软、腐败液渗出、泡沫状，直至完全液化；从无臭味到发臭，最后臭味又消失。RGB值与 PMI存在一定相关性，其中R值在0 h~30 h线性关系最好：YPMI=-0.314XR+55.41(R2=0.779、SE=4.898)
　　(2)组织生物力学形状参数：甲醛固定脑组织的生物力学参数中，与PMI显著相关的有极限载荷、平均力、最大模量、断裂能量，均呈时序性下降趋势(P<0.05)，回归方程分别是YPMI=-4.314X极限载荷/最大力+58.94(R2=0.888、SE=6.542)，YPMI=-3.990X断裂能量+53.62(R2=0.770、SE=9.143)，YPMI=-1.535 X弹性模量+64.52(R2=0.883、SE=6.724)，YPMI=-10.03X平均力+58.66(R2=0.741、SE=9.695)。4个生物力学参数多元线性逐步回归分析：YPMI=62.99-1.666 X最大力-0.896X断裂能量-0.494X弹性模量-1.786X平均力(R2=0.923、SE=5.256)。回归模型各参数t检验均有统计学意义(P<0.05)，比单因素回归模型更优。
　　(3) HE和Glees神经纤维染色图像分析中，其 RE和IOD值0 h~48 h期间 RE和IOD逐步增大，48 h~60 h较为平稳甚至下降。HE染色的 RE和IOD拟合回归方程分别为YPMI=13.45X+155.8(R2=0.406、SE=14.24)，YPMI=12.97X+2.197×10^-7(R2=
　　0.440、SE=14.03)；Glees神经纤维染色的 RE和IOD拟合回归方程分别为：YPMI=14.99X+186.7(R2=0.401、SE=14.25)、YPMI=9.391X+2.731×10^-7(R2=0.638、SE=11.24)。
　　4、综合分析
　　选取25℃组0 h~84 h脑组织多个检测指标为自变量 X，PMI为因变量Y，进行多元逐步线性回归分析，选择拟合度最好的回归方程：YPMI=38.46–2.280X最大力+11.10Xγ-氨基丁酸–2.509X平均力(R2=0.976、SE=2.964)。
　　结论：
　　1、应用GC-MS检测出脑组织各类氨基酸、有机酸、脂肪酸等降解产物时序性变化的机制，实质上是基于尸体器官组织死后的自溶腐败过程，也是组织形态学和生物力学形状参数时序性变化的构效关系的物质基础，构成了脑尸体组织代谢组学、形态学和生物力学推断PMI的理论依据。
　　2、GC-MS检测出脑组织的多种腐败产物与 PMI之间存在显著相关性，，证实了代谢组学理论和技术推断 PMI的可行性和准确性，而且3个温度组各个物质其生成速率明显不同，比值约为1:2.5~14:3.5~24。
　　3、应用PCA和PLS/OPLS-DA等多元模式分析方法，进行 PMI推断模型建立的，可更好地了生化物质降解趋势和规律，提高 PMI推断的准确性。综合多个指标进行多元逐步回归分析也能提高推断的精确度。
　　4、脑组织生物力学性状和形态学观察随 PMI延长的时序性变化与前期研究结果趋势相似，证明了其应用于推断 PMI的可行性，与生物化学方法结合，可提高近1倍的精确度。

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缩略语释义表

目录

前言

第1部分 不同温度条件下家猪死后脑组织GC-MS代谢组学检测和死亡时间推断的研究

引言

第一章 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法学考察

1.3 家猪脑组织实验标本GC-MS检测

1.4 GC-MS质谱数据处理和统计分析方法

第二章 结果

2.1 方法考察

2.2 代谢物谱分析与物质定性定量

2.3 模式识别：各温度组总代谢物质的降解规律

2.4 PLS模型的建立和比较

第三章 讨论

3.1 方法学考察

3.2 代谢物质谱图鉴定及与 PMI 的关系

3.3 多元统计模型建立与分析

附表和附图

第2部分 家猪死后脑组织生物力学和形态学变化规律死亡时间推断的研究

引言

第一章 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

第二章 结果

2.1 家猪脑组织大体形态改变

2.2 大体颜色RGB值变化

2.3 生物力学性状检测指标

2.4 脑组织染色光学显微镜观察和计算机病理图像分析

2.5 脑组织各项指标推断PMI结果比较和综合分析

第三章 讨论

3.1 脑组织大体形态、生物力学和量化病理学检测

3.2 PMI推断方法的比较

附图

结论

参考文献

文献综述: 尸体化学在死亡时间推断的研究进展以及代谢组学的应用前景

个人简历及在读期间发表论文情况

致谢