EGCG减少肺表面活性蛋白A2(SP-A2)突变致蛋白沉积的作用及机制

摘要

背景和目的：肺纤维化是一种慢性进行性弥漫性的，以纤维化为特点的肺间质疾病，主要包括特发性肺纤维化(IPF)和家族性肺纤维化（FPF）。发病率极高，预后较差，且五年生存率仅为50％-60%，然而目前却仍无有效的药物能够防治肺纤维化。这给人类生命健康带来了极大的威胁和困扰，也给国民经济带来沉重的负担，因此寻找有效可行的治疗肺纤维化的药物显得尤为重要。
　　肺表面活性蛋白A2（SP-A2）在维持肺的自稳态方面发挥着非常重要的作用。近年来，对家族性肺纤维化病人的全基因组关联分析（GWAS），发现在SP-A2的CRD结构域有两个典型的突变（F198S和G231V），并且发现这两个突变与肺纤维化的发生密切相关。体外细胞实验发现，SP-A2基因发生突变后蛋白正常折叠过程和分泌受阻，使得错误折叠蛋白滞留在内质网上，诱发内质网应激。
　　已有大量的报道证明天然小分子化合物表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）能够通过多种机制使细胞内的错误沉积蛋白降解成无细胞毒性的单体。因此，本课题旨在探索EGCG是否影响SP-A2突变蛋白在细胞内的合成、沉积、分泌以及蛋白的稳定性，并阐明此过程中可能的分子机制，为肺纤维化的临床治疗及药物开发提供理论依据。
　　方法：构建野生型及突变型SP-A2质粒，并转染到CHO-K1细胞中进行过表达。利用蛋白质免疫印迹的方法检测EGCG对野生型及突变型SP-A2蛋白的合成、沉淀、分泌以及降解等的影响；利用免疫荧光技术检测 EGCG处理后的野生型及突变型SP-A2蛋白的亚细胞定位改变情况；利用α-胰凝乳蛋白酶水解实验检测EGCG对SP-A2蛋白稳定性的影响。
　　结果：EGCG浓度依赖性地减少SP-A2突变蛋白在细胞内的沉积及野生型SP-A2成熟蛋白向细胞外的分泌；EGCG可以减少由G231V突变引起的野生型SP-A2蛋白的沉积，降低野生型及突变型SP-A2蛋白的稳定性，并通过蛋白酶体途径促进SP-A2突变蛋白的降解；另外，EGCG与化学分子伴侣物质4-苯丁酸钠（4PBA）联合处理时，细胞内SP-A2突变蛋白沉积减少更加明显。
　　结论：EGCG能够减少SP-A2突变蛋白在细胞内的沉积，发挥的分子机制是EGCG能够降低蛋白的稳定性，激活蛋白酶体降解途径，使错误折叠蛋白被降解，因此，EGCG可能成为肺纤维化治疗的靶标药物。

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第一章 前言

肺纤维化的流行病学及其危害

病因学分析

肺表面活性蛋白和肺纤维化

肺纤维化的治疗

EGCG可能成为肺纤维化治疗的靶标

第二章 材料和方法

2.1 材料

2.2主要仪器设配

2.3 主要溶液配制

2.4 实验方法

2.5 统计分析

第三章 结果

3.1 EGCG减少SP-A2突变蛋白在细胞内的沉积及野生型SP-A2蛋白向细胞外的分泌

3.2 EGCG可以减少SP-A2突变蛋白在内质网上的沉积

3.3 EGCG可以减少G231V突变蛋白造成的野生型SP-A2蛋白沉积

3.4 EGCG不影响分子伴侣GRP78/Bip蛋白在细胞中的表达

3.5 EGCG与4PBA联合处理使SP-A2突变蛋白沉积减少更明显

3.6 EGCG降低了野生型及突变型SP-A2蛋白的稳定性

3.7 EGCG可通过蛋白酶体降解途径减少SP-A2突变蛋白沉积

第四章 讨论

第五章 结论

第六章 参考文献

致谢

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