转录因子FOXO3表达抑制对人胚胎干细胞心肌定向分化的影响

摘要

背景：心衰，是世界上致死的主要疾病之一。随着我国人民生活水平的提高及人口老龄化，心血管疾病发病率持续升高。随着干细胞研究的深入，尤其是基于干细胞疗法的研究进展，使人为替换病损心肌根治心衰成为可能。然而，经过10多年来临床前研究和临床研究的努力，由于缺乏对心肌分化的分子调控机制的足够了解，细胞疗法仍然不能够作为常规疗法用于心衰病人。转基因动物研究显示FOXO家族成员对小鼠的心脏发育具有重要的调控作用，但尚无其参与人心脏发育调控的直接证据。我们前期研究结果发现FOXO3在人心肌分化过程中表达升高且处于转录活化状态。因此推测FOXO3在人胚胎干细胞向心肌定向分化过程中起到一定的调控作用。
　　目的：通过观察FOXO3敲低人胚胎干细胞系向心肌细胞分化过程中中胚层及心肌分化特异性标记基因NKX2.5、ISL-1、TBX5、TBX20、Myocardin、Troponin T等的表达变化，观察FOXO3基因表达的改变对人心肌细胞分化的进程及效率的影响，证实FOXO3在人胚胎干细胞向心肌定向分化过程中的调控作用。
　　方法：
　　1.利用慢病毒载体介导的RNA干扰技术（shRNA）建立FOXO3敲低的HES2人胚胎干细胞系。
　　2.通过蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR技术检测FOXO3敲低的HES2细胞中FOXO3基因表达情况。
　　3.通过碱性磷酸酶染色、细胞免疫荧光染色、蛋白免疫印迹及实时荧光定量PCR等技术检测FOXO3敲低HES2细胞多能性特异性标记物的表达情况，观察FOXO3表达抑制对人胚胎干细胞多能性的影响。
　　4.采用无血清培养技术诱导人胚胎干细胞向心肌细胞分化，在心肌细胞分化的不同时间点检测细胞中胚层及心肌分化特异性标记基因的表达情况，观察FOXO3表达抑制对心肌细胞分化的影响。
　　5.流式细胞术检测诱导心肌细胞分化末期各实验组细胞中特异性标记肌钙蛋白T（TroponinT）阳性的细胞比例。
　　结果：
　　1.包装制备表达FOXO3特异性shRNA的慢病毒，感染HES2细胞并筛选获得了GFP+/ZEOCIN抗性克隆。
　　2.在筛选得到的GFP+/ZEOCIN抗性HES2细胞中，内源性FOXO3的表达在mRNA水平及蛋白水平均被抑制。
　　3.内源性FOXO3表达的抑制并未改变人胚胎干细胞多能性标志物的表达水平。
　　4.FOXO3表达的抑制影响了人胚胎干细胞向心肌分化过程中的某些心肌分化特异性标记基因的表达。
　　5.FOXO3表达的抑制使人胚胎干细胞向心肌分化末期心肌特异性标记肌钙蛋白T（TroponinT）阳性细胞的比例明显降低。
　　结论：
　　1.成功构建FOXO3敲低人胚胎干细胞系表明，慢病毒载体可高效介导外源性基因进入难转染的人胚胎干细胞中。
　　2.FOXO3表达抑制对人胚胎干细胞的多能性无明显影响。
　　3.FOXO3表达抑制影响心肌细胞的正常分化，明显降低心肌分化效率，证实FOXO3在人胚胎干细胞向心肌细胞分化过程起到一定的调控作用。

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第一章 前言

第二章 材料、对象与方法

2.1 实验仪器和设备

2.2 主要试剂

2.3 细胞株

2.4 实验主要相关试剂的配制

2.5 实验器械的处理

2.6 实验方法

2.7 统计学处理

第三章 实验结果

3.1 稳定表达FOXO3 shRNA的人胚胎干细胞系的建立

3.2 FOXO3表达抑制对人胚胎干细胞心肌分化进程及效率的影响

第四章 讨论

4.1 人胚胎干细胞源性心肌细胞分化研究的优越性

4.2 RNA干扰技术构建FOXO3敲低人胚胎干细胞系

4.3 FOXO3表达的抑制对人胚胎干细胞的多能性的影响

4.4 FOXO3表达的抑制对心肌分化进程的影响

4.5 FOXO3表达的抑制对心肌分化效率的影响

4.6 不足与展望

第五章 结论

参考文献

致谢

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