基于犬尿氨酸代谢通路探索抑郁症治疗的生物标记物

摘要

重性抑郁障碍（Major Depressive Disorder，MDD）通常又称为抑郁症，临床上以情绪低落、快感丧失为主要特征，并常常伴有失眠、食欲降低、体重减轻及性欲减退等躯体症状。目前，抑郁症已成为世界第四大疾病，寻找与抑郁症的发病与转归关系密切的体内生物标记物，以作为更客观反映病情进展与药物疗效的评价标准一直是抑郁症临床治疗亟待解决的问题。本研究分为四个部分：
　　第一部分：LC-MS/MS测定人血清中犬尿氨酸能活性物质方法的建立及验证。
　　目的：
　　建立测定人血清中的色氨酸（TRP），犬尿氨酸（KYN）和犬尿喹啉酸（KYNA）的高效液相串联质谱方法。
　　方法：
　　采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm）为固定相，TRP-KYN流动相为甲醇：水（45:55，v/v，各含5 mmoL·L-1甲酸铵）；KYNA流动相为甲醇:水（35:65，v/v，各含5 mmoL·L-1甲酸铵），流速为0.5 mL·min-1，柱温35℃。质谱条件采用电喷雾电离源（ESI），检测方式为正离子模式，多重反应监测（MRM）进行测定。分析物的离子质荷比分别为m/z205.1→188.1（TRP），m/z209.1→146.1（KYN），m/z190.1→144.1（KYNA），m/z214.1→149.1（KYN-13C415N），m/z195.1→149.1（KYNA-d5）。
　　结果：
　　TRP，KYN和KYNA的标准曲线范围分别为1000～50000、100～5000及1～60 ng·mL-1，且线性良好。TRP，KYN和KYNA的四个质控（QC）浓度的准确度在88.20％～108.31%，日内精密度 RSD在0.55%～2.67%，日间精密度RSD在2.80%～10.73%。色氨酸，犬尿氨酸和犬尿喹啉酸血样在-20℃冷冻90天的稳定性良好。
　　第二部分：LC-MS/MS测定人血清中犬尿氨酸能活性物质的临床应用。
　　目的：
　　考察在健康受试者与抑郁症患者血清中犬尿氨酸能活性物质含量的差异；考察抑郁症患者重复经颅磁刺激（rTMS）治疗前后犬尿氨酸活性物质含量的变化趋势。
　　方法：
　　收集健康受试者（26例）及重复经颅磁刺激治疗抑郁症患者（54例）的血清，采用LC-MS/MS检测方法测定血清中TRP，KYN和KYNA的含量。
　　结果：
　　抑郁症患者血清中TRP，KYN和KYNA的浓度显著低于健康受试者，前两者的差异具有统计学意义（P<0.05），但KYNA浓度差异无统计学意义（P>0.05）。抑郁症患者经 rTMS治疗前后三种物质浓度差异无统计学意义（P>0.05）。
　　第三部分：基于抑郁大鼠模型探究其血浆中的犬尿氨酸能活性物质。
　　目的：
　　考察抑郁组与对照组大鼠血浆中犬尿氨酸能活性物质及其代谢酶的含量变化。
　　方法：
　　基于LC-MS/MS法，建立大鼠血浆中TRP，KYN和KYNA的含量测定方法。通过28天慢性轻度不可预见性应激刺激（CUMS）建立抑郁大鼠模型，并进行行为学测定。通过ELISA试剂盒检测代谢酶吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）和犬尿氨酸氨基转移酶（KAT）的含量。
　　结果：
　　经过28天CUMS应激，大鼠体重、24 h摄食量、糖水偏爱度均小于对照组；旷场（Open-Field）实验运动总路程及站立次数也小于对照组，且差异有统计学意义（P<0.05）。造模前大鼠血浆中TRP、KYN和KYNA的含量分别为13815.42±1755.61 ng·mL-1，315.92±84.36 ng·mL-1，8.70±3.00 ng·mL-1；在造模28d后，抑郁模型组大鼠血浆中TRP， KYN和KYNA的含量均低于对照组，且差异有统计学意义（P<0.05）。抑郁模型大鼠血浆中的IDO和KATⅡ酶含量均相对高于对照组大鼠，且从造模14 d开始两组差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　第四部分：抑郁模型大鼠血浆中文拉法辛及其代谢物的药代动力学研究。
　　目的：
　　比较抑郁模型大鼠血浆中文拉法辛（VLF）及其代谢物O-去甲基文拉法辛（ODV）与对照组大鼠的药代动力学差异。考察给予文拉法辛治疗前后，抑郁模型大鼠血浆中TRP、KYN和KYNA的含量变化。
　　方法：
　　基于LC-MS/MS法建立同时检测大鼠血浆中VLF及ODV的方法学并验证。通过CUMS建立大鼠抑郁模型，分别选择8只健康和抑郁大鼠，给予盐酸文拉法辛原料药（20.25 mg·kg-1），分别于给药前和给药后10，20，30，40，60，90，120，180，240，300，360，480 min取血，计算其药代动力学参数。
　　结果：
　　抑郁症组VLF的AUC0-8和 AUC∞从314.18±170.97μg·h·L-1和329.25±184.53μg·h·L-1显着升高至703.25±334.22μg·h·L-1和754.52±367.96μg·h·L-1，增加约2.24倍和2.29倍（P<0.05）；对照组和抑郁组CL/F分别为86.66 L·h-1·kg-1和41.25 L·h-1·kg-1，抑郁组下降约52%，显示抑郁组中的大鼠表现为更快的吸收和缓慢的消除。抑郁模型组ODV的Cmax，AUC0-8和AUC∞与对照组比较有差异，分别为对照组的3.07倍，1.82倍和2.22倍，但差异无统计学意义（P>0.05）。经过4周刺激，抑郁模型组大鼠血浆中TRP、KYN和KYNA的含量总体呈下降趋势，当给予抗抑郁药文拉法辛后，其呈现上升趋势。
　　结论：
　　⑴开发了简单且快速的LC-MS/MS方法测定人血清中及大鼠血浆中TRP，KYN和KYNA的含量，及同时测定大鼠血浆中VLF及ODV的含量。⑵抑郁症患者血清中TRP、KYN和KYNA含量低于健康受试者，并用抑郁大鼠模型验证及确证，TRP、KYN和KYNA可考虑作为抑郁症的发病与转归的体内生物标记物。⑶抑郁模型大鼠对VLF表现为缓慢的吸收和消除。

目录

声明

英文缩略词表

前言

第一部分LC-MS/MS测定人血清中犬尿氨酸能活性物质的建立及验证

1 实验仪器与试剂

2 方法学的建立及验证

3 方法学的验证结果

4讨论

第二部分LC-MS/MS测定人血清中犬尿氨酸能活性物质的临床应用

1 对象

2方法

3 结果

4 讨论

第三部分基于抑郁大鼠模型探究其血浆中的犬尿氨酸能活性物质

1实验仪器试剂与实验动物

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分抑郁模型大鼠血浆中文拉法辛及其代谢物的药代动力学研究

1 实验仪器试剂与实验动物

2方法

3结果

4 讨论

总结

参考文献

综述:与抑郁症疾病相关的生物标记物研究

附录

个人简历

研究生期间论文发表情况

致谢