机械性损伤诱导的细胞因子级联反应调控小鼠神经元VGSCs的实验研究

摘要

1.背景和目的:创伤性急性颅脑损伤可以触发即时的初级脑组织损伤和长期的次级脑损伤，创伤后的次级脑组织损伤持续时间不等，可以持续数个小时到数天甚至伴随病人终生。次级损伤的诱发机制较为复杂，包括炎症介质（主要是细胞因子）对兴奋性离子通道的的影响。电压门控钠通道（VGSCs）是形成动作电位的上升支的基础，控制着神经元的兴奋性和动作电位的形成，对于可兴奋细胞的电生理学特性至关重要。目前为止，在颅脑外伤的次级损伤中，炎性细胞因子对电压门控钠通道（VGSCs)以及神经细胞兴奋性的影响还不甚了解，需作进一步探索。
　　2.方法
　　2.1小鼠原代皮层神经元和星形胶质细胞混合培养至两周左右遭受机械性损伤处理，体外模拟急性颅脑损伤；
　　2.2在混合培养细胞遭受机械性损伤处理6h和24h后分别用荧光定量PCR和酶联免疫吸附实验检测其多种炎性细胞因子在mRNA和蛋白水平的变化；
　　2.3用机械损伤处理过的条件混合培养上清（添加或不添加脑源性神经营养因子，BDNF）孵育小鼠原代皮层神经元纯培养物来模拟颅脑损伤后的免疫微环境中多种细胞因子对损伤远隔部位正常神经元的影响以及BDNF在该环境下对正常神经元的保护作用；
　　2.4机械损伤条件上清孵育神经元纯培养物不同时间点6h和24h，电压钳全细胞记录模式下检测钠电流的变化；
　　2.5不同剂量(0.1，1,5,10,50,100 ng/ml) BDNF联合机械性损伤条件上清孵育神经元，电压钳全细胞记录模式下检测钠电流的变化；
　　2.6机械性损伤条件上清（添加或不添加BDNF30 ng/ml）处理神经元，拟合电压门控钠通道的激活、快速失活动力学曲线和失活后的复活曲线；
　　2.7机械损伤条件上清（添加或不添加BDNF30 ng/ml）孵育神经元细胞，观察神经元静息电位、电压门控钠通道反转电位的变化；
　　2.8机械损伤条件上清（添加或不添加BDNF30 ng/ml）孵育神经元细胞，电流钳检测神经元动作电位各个参数（放电阈值和放电频率）的变化，验证机械性损伤条件上清对皮层神经元兴奋性的影响以及BDNF在这一过程中是否具有神经保护作用；
　　2.9机械性损伤条件上清联合BDNF30 ng/ml（+ mTOR的抑制剂Rapamycin(50 nM)或+PI3K抑制剂TGX-221(1μM)或+ERK抑制剂U0126（30μM））全细胞模式下记录各组钠电流和动作电位参数的变化，寻找BDNF抑制条件上清诱导钠电流增强的可能信号通路；
　　3.结果
　　3.1混合培养培养物经机械性划伤后6h在 mRNA水平显著上调多种细胞因子包括IL-1β、IL-6/TNF-α、MCP-1、CCL-5、IL-10、TGF-β1，其中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1在培养上清中的分泌水平均有显著上调，证实该体外细胞模型在一定程度上能够模拟急性颅脑损伤后形成的免疫微环境；
　　3.2机械性划伤后的条件上清孵育皮层神经元纯培养物6h或24h后，与对照组相比均显著上调电压门控钠电流密度，BDNF（30 ng/ml）联合划伤条件上清共孵育神经元，能显著抑制条件上清诱导的钠电流密度增强，并且 BDNF的这种抑制效应在一定范围内具有剂量依赖效应，即随 BDNF剂量的增加，BDNF的钠电流抑制作用也随之增强(IC50=43.33 ng/ml)；
　　3.3划伤条件上清和BDNF对电压门控钠通道的激活，快速失活和失活后的复活均无大幅度的改变，即划伤条件上清和 BDNF在电压门控钠通道动力学特性上均无显著影响；
　　3.4划伤条件上清孵育神经元6h或24h，显著增强电压门控钠通道功能性α亚基在神经元细胞膜上表达，BDNF联合条件上清共孵育24h显著地抑制细胞膜上功能性的电压门控钠通道α亚基的表达量；
　　3.5划伤条件上清作用6h或24h后显著地降低了神经元的细胞活性，共孵育BDNF的情况下，在6h细胞活性相对于对照组无显著改变，在24h细胞活性相对于对照组仍有一定程度的降低；
　　3.6划伤条件上清在动作电位方面的影响表现为：孵育6h或24h时均未引起放电阈值的显著改变，但显著增强了放电频率。在联合BDNF共孵育6h时，显著抑制动作电位的放电频率，共孵育24h时，BDNF并未显著改变增强的放电频率；
　　3.7与划伤条件上清联合BDNF作用组相比，添加PI3K抑制剂或ERK抑制剂于联合作用组均未显著改变BDNF引起的钠电流降低作用，添加mTOR抑制剂于联合作用组后可轻微地逆转联合作用组引起的钠电流降低作用；
　　3.8 mTOR抑制剂（Rapamycin）+BDNF+划伤条件上清作用组未显著改变mTOR通路的下游关键靶蛋白p70S6K的磷酸化水平，但在划伤的混合培养物中，划伤后显著抑制p70S6K的磷酸化水平，且BDNF可显著逆转改磷酸化水平的改变，在神经元纯培养物中，BDNF单独作用亦显著增强p70S6K的磷酸化水平。
　　4.结论:在该体外机械性颅脑损伤细胞模型中，神经元和胶质混合培养物的机械性损伤诱发炎性介质（包括多种促炎细胞因子、抑炎因子、趋化因子以及神经营养类因子）的急剧上调，一定程度上模拟了急性颅脑损伤后的免疫微环境.将该环境转移至正常的神经元纯培养物后，多种炎性介质（主要是多种细胞因子）共同发挥作用上调电压门控钠电流和神经元的放电频率，暗示该环境在单个细胞水平能够诱发神经兴奋改变，这些兴奋性改变在一定程度上可被脑源性神经营养因子逆转。一系列的结果提示机械性损伤触发的多种细胞因子爆发可能直接参与损伤部位远端完整神经元的电压门控钠通道异常和神经兴奋性功能障碍。脑源性神经营养因子可能通过保护损伤远隔部位完整神经电压门控钠通道功能来维持神经炎症环境中神经兴奋性的稳态平衡。

目录

声明

英文词缩略表

综述：神经炎症与外伤性颅脑损伤的次级损伤

第一章 引 言

1.1 研究背景

1.2 国内外研究现状

1.3. 研究的目的和意义

第二章 材料和方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3资料分析与数据处理

第三章 结 果

3.1外伤性颅脑损伤体外细胞模型的建立

3.2创伤性的炎性微环境上调神经元电压门控钠电流

3.3创伤性的炎性微环境改变VGSC的动力学特性

3.4创伤性的炎性微环境上调神经元功能性VGSC的表达

3.5创伤性免疫微环境降低神经元细胞活性

3.6创伤性的炎性微环境改变神经元的放电特性

第四章 讨 论

4.1炎性微环境通过上调VGSC钠电流加剧TBI次级损伤

4.2炎性细胞因子调控VGSC的相关机制

4.3 BDNF通过维持VGSC的正常功能发挥神经保护性作用

4.4本研究的局限性

4.5 结论

第五章 结 语

参考文献

附 录 一

附 录 二

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢

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