改良梯度凝胶电泳法检测冠心病患者血清HDL亚类的研究

摘要

冠心病(CHD)具有高发病率和高死亡率的临床特征，严重威胁着人类健康。大量研究已经证实血脂异常是CHD的重要危险因素之一，并直接参与其发病机制。过去20余年，从饮食控制到他汀类药物为主的大规模多中心临床试验几乎一致表明，调脂治疗可以使CHD患者的主要心脏事件(不稳定性心绞痛、心肌梗死、猝死等)的发生率和死亡率显著降低。基于循证医学的证据，通过调脂干预防治CHD的临床策略得到一致公认，并在实践中成功地取得了明显的效益。 临床评价血脂异常与否的指标很多，早期比较重视高脂血症的危险。治疗上以降脂为主，通常采用他汀类和/或贝特类药物来降低总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和甘油三酯(TG)。然而调查发现，部分确诊CHD患者的血脂水平正常，难以从单因素的角度分析血脂异常在冠心病发病机制中的作用。 高密度脂蛋白(HDL)具有抗动脉粥样硬化的保护作用，其机制主要与其逆转运胆固醇(RCT)、保护血管内皮功能、抗脂质过氧化损伤和抑制炎症反应等作用有关。流行病学证据表明，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低是冠心病的一个独立危险因素。因此，防治血脂异常的策略演进以调脂为主，其重点在于降低LDL-C和升高HDL-C。常规检测HDL-C水平表达的仅是HDL中胆固醇的含量，有研究认为HDL-C并不能确切反映HDL在RCT中的功能。 通过HDL亚类表达RCT的状态一直是研究的热点之一。HDL各亚类参与RCT过程，同时本身的组成和颗粒大小发生变化，其异常与动脉粥样硬化、冠心病有着良好的相关性，是动脉粥样硬化及冠心病的独立危险因素。血清HDL的组成非常复杂，包括多种亚类。梯度超速离心法通常将HDL按照其密度分为HDL2和HDL3。梯度凝胶电泳(GGE)法可按颗粒大小进一步将HDL2分为HDL2b、HDL2a，HDL3分为HDL3a、HDL3b和HDL3c临床研究显示这些亚类在CHD和糖尿病患者中显著改变，这些变化可能作为RCT损伤的标志。另外，人血清还有较低密度的HDL1和极高密度脂蛋白(VHDL)，正常情况下两者含量极低，代谢极快，一般方法难以检测，故对它们的研究甚少。 以往研究HDL亚类的方法存在一些问题。首先，通常需要昂贵的设备，操作费时，很难大规模应用。其次，由于HDL与其它脂蛋白(Non-HDL)的颗粒特性差异悬殊，难以在同一检测系统中兼顾它们从而取得同步表达的满意效果，因此以往方法只能忽略Non-HDL而仅对HDL亚类进行分析，这样就难以顺应目前综合多因素分析血脂状态的发展趋势。 改良梯度凝胶电泳法(GGE法)改良了传统GGE的凝胶设置，采用分段梯度凝胶电泳法，同步分离血清HDL亚类和Non-HDL，能够将HDL分离出明显的10条亚带，提高了分辨能力；在定量方法上采取统一的参照点，量化出各组分在同一总体中的相对含量，达到了全面分析血脂整体概貌的效果。重复性实验显示，改良GGE法具有良好的稳定性，变异系数(CV)达到了国家血脂检测标准化的要求。目前该研究平台已经建立，初步取得的一些资料提示HDL亚类的含量在不同疾病状态下表现近乎规律的变化，其表达HDL的效果较常规HDL-C指标提示更多的信息，并将在系列研究中逐步得到验证和应用。 目的： 高密度脂蛋白(HDL)具有抗动脉粥样硬化的作用，是冠心病(CHD)的保护因子，其机制主要与胆固醇逆转运(RCT)有关。通过HDL亚类表达RCT的状态是研究的热点之一。本研究应用改良密度梯度凝胶电泳(GGE)法检测HDL亚类，初步调查CHD患者血清HDL亚类的临床特点，为深入基础研究寻找线索。 对象与方法： 1、研究对象： 1.1健康成人调查的研究从单位体检人群中筛选151例，其中男81例，女70例。 1.2病例对照研究体检健康人群40例入选健康对照组，其中男34例，女6例；住院患者73例入选疾病组，其中，非CHD的其它疾病(Non-CHD)组19例，男12例，女7例；CHD组54例，男40例，女14例。 2、研究方法：常规检测研究对象的血脂水平(TG、TC、LDL-C和liDL-C)，同时采用改良GGE法检测研究对象的血清HDL及其亚类含量；根据健康成人调查研究的结果，初步得出血清HDL及其亚类的异常状态和判断标准。病例对照研究比较他们的均值和异常率的组间差异，疾病组按照常规血脂异常的标准进行分组，比较不同血脂状态下HDL及其亚类含量的均值和异常率的差异，疾病组还进一步按照冠状动脉造影结果Gensini积分(GS)进行分组，比较HDL各亚类含量的组间差异。 3.统计方法：计量数据用均值±标准差表示，计量数据用率表示。用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料的比较用t检验、方差分析及非参数检验，均值的组间两两比较采用LSD法，计数资料率的比较用卡方检验，P≤0.05表示有显著性差异。 结果： 1.改良GGE法可将血清HDL同步分离出10条可见的电泳亚带，将其归为4种亚类：HDL(A)、HDL(B)、HDL(C)和HDL(V)。其中，HDL(A)电泳迁移最慢，颗粒最大，胆固醇的相对含量最高；HDL(V)在分离凝胶中呈独立分带，电泳迁移最快，颗粒最小，胆固醇的相对含量最低。经过光密度扫描仪扫描，即可得到血清HDL亚类的电泳图谱及量化结果。 2.应用改良GGE法检测151例健康成人血清HDL及其亚类的含量，初步得出血清HDL及其各亚类异常状态和判断标准。 3.在健康对照组、CHD组及Non-CHD组中，HDL-C水平在CHD组和Non-CHD组均较健康对照组显著降低(P<0.001)，疾病组间比较差异无显著性意义；用改良GGE法检测HDL总量在CHD组较健康对照组显著降低(P<0.01)，在Non-CHD组有所降低，但与健康对照组和CHD组比较均无显著性意义；HDL(A)含量异常升高的情况仅仅出现在CHD组中；与健康对照组相比，在CHD组和Non-CHD组的HDL(B)含量显著降低，HDL(C)含量显著升高，疾病组间比较差异无显著性意义；HDL(V)含量降低仅仅出现在CHD组，较Non-CHD组和健康组均显著降低(P<0.01，P<0.001)。 4.在CHD组内，HDL总量在血脂升高和HDL-C降低的状态下降低更明显，与血脂不高、HDL-C不低的状态下相比差异分别有显著性意义(P<0.001，P<0.01)；HDL(B)含量在血脂升高和HDL-C降低的状态下降低的更明显(P<0.001，P<0.01)；HDL(V)含量在血脂升高的状态下降低的更明显(P<0.05)。按照Gensini积分分组，HDL(A)和HDL(V)与冠状动脉狭窄严重程度有关联，在GS>60组HDL(A)含量显著升高(P<0.01)，HDL(V)含量显著降低(P<0.05)。 5.改良GGE法检测HDL及其亚类总的异常率在CHD组和Non-CHD组分别为67％和42％。在CHD组内，无论血脂升高与否，HDL及其亚类的异常率均较高。在Non-CHD组内，在血脂升高或HDL-C降低的状态下，HDL及其亚类总的异常率均较高。HDL总量的异常率在血脂升高的情况下更明显。 结论： 1.改良GGE法检测血清HDL及其亚类的表现与以往方法不同，其优势体现在同步分离的高分辨能力和整体水平的定量分析上。 2.CHD患者血清HDL亚类含量处于不协调的相对关系，表现为HDL(B)和HDL(V)相对含量降低、HDL(A)和HDL(C)相对含量升高，可能提示RCT异常。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

对象与方法

1.研究对象

2.血样的采集和处理

3.血脂检测方法

4.统计方法

结果

1.同步分离和量化分析

2.健康成人组的调查

3.病例对照研究

讨论

1.临床分析血脂的思路

2.改良GGE法的建立和初步应用

3.血清HDL及其亚类与冠心病的关系

结论

论文不足之处

参考文献

附件:中英文缩略词对照表

文献综述高密度脂蛋白亚类研究进展

攻读硕士期间发表论文情况

致谢

研究生毕业论文统计学审稿证明