磷酸二酯酶抑制剂对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

摘要

目的：以大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤为动物模型，观察咯利普兰(Rolipram)对学习记忆障碍的保护作用及己酮可可碱(Pentoxifylline，PTX)对脑缺血后海马区新生细胞存活的影响，并在此基础上探讨磷酸二酯酶抑制剂的作用机制。体外培养海马神经元和PC12细胞，建立缺氧/再给氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)损伤模型，观察咯利普兰对细胞形态及细胞活力的影响。 方法：(1)咯利普兰(1mg/kg)连续腹腔给药15d，参照LongaEZ线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。造模后d8、d13分别对大鼠进行Morris水迷宫测试训练和避暗测试。造模后d15，断头取脑并迅速取出海马组织，制备成组织匀浆，应用高效液相色谱分析(HPLC)法测定海马组织磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)活性。(2)体外培养海马神经元和PC12细胞，分别应用物理、化学两种方法建立细胞H/R损伤模型，观察细胞形态学改变，并且应用四甲基偶氮唑蓝法(methylthiazolyltetrazolium，MTT)观察不同浓度咯利普兰对细胞活力的影响，测定细胞外液乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)浓度。(3)建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，造模9d后给予BrdU(50mg/kg)进行标记，4次/d，间隔2h给药1次。标记后d7腹腔注射不同剂量的PTX(20mg/kg或40mg/kg)，连续22d。在BrdU标记后d30处死大鼠。取脑组织做冷冻切片，行免疫组化法观察PTX对大鼠缺血再灌注后脑组织海马齿状回BrdU阳性细胞数的影响。 结果：(1)在Morris水迷宫测试中，各组大鼠在d1的潜伏期没有显著差异；d4与d7模型组大鼠的潜伏期明显延长，分别为27.700±13.407s、14.540±4.408s；咯利普兰显著缩短了模型大鼠的寻台时间，潜伏期分别为15.945±8.791s、10.347±3.940s。大鼠在Morris水迷宫中到达平台的平均路程在d4与d7均有显著差异：模型组大鼠的泳程分别为262.078±181.067cm、139.873±31.063cm；咯利普兰组的泳程为125.292±45.707cm、110.545±14.567cm较模型组显著缩短。在避暗实验中，模型组大鼠的潜伏期显著降低(110.563±61.817s)，错误次数显著增加(1.125±0.991次)；咯利普兰显著增加了模型大鼠的潜伏期(168.500±60.564S)，错误次数显著减少(0.750±0.707次)。通过HPLC检测分析得知：与正常对照组相比，模型组大鼠海马组织PDE4活性显著升高(34.338±7.974μmol/g/min)；与模型组相比，咯利普兰组PDE4活性显著降低(26.913±7.105μmol/g/min)。(2)结合海马神经元在倒置显微镜下的形态学特征及神经微丝(NF200)抗原的鉴定结果，确认分离培养的为神经元。缺氧/再给氧损伤后，细胞形态发生了一定的改变，咯利普兰10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L三个剂量均显著降低了缺氧/再给氧损伤对PC12细胞及海马神经元造成的损伤：PC12细胞的A值由模型组的0.287±0.080增加到0.391±0.096、0.396±0.104、0.425±0.080；神经元的A值由0.155±0.043增加到0.236±0.041、0.244±0.089、0.253±0.054。与模型组506.658±28.412相比，应用咯利普兰后PC12细胞各组细胞外液LDH也逐渐降低呈浓度依赖趋势LDH分别为472.284±27.442、448.551±24.684、437.320±41.231；咯利普兰显著减少了海马神经元细胞外液LDH值，从模型组的531.790±70.054U/L分别减少为404.460±89.568U/L、399.372±88.476U/L、388.428±127.281U/L。(3)在倒置显微镜下观察成年大鼠脑缺血损伤后海马齿状回BrdU免疫阳性细胞的分布。BrdU免疫阳性细胞表现为椭圆形或不规则形状的细胞核，并呈现明显的“丛集”现象。本实验中阴性对照海马齿状回(Dentategyrus，DG)区未见BrdU免疫阳性细胞。BrdU给药30d后，空白对照组大鼠DG区仅见少量散在的BrdU免疫阳性细胞，细胞百分比率为(100.000±18.365)，方差分析结果显示：与空白对照组相比，模型组DG区BrdU免疫阳性细胞比率显著增加为(129.358±18.378)，可可碱对照组免疫阳性细胞比率也有少量增加(108.217±15.743)；与模型组相比，PTX20mg/kg、40mg/kg治疗组BrdU免疫阳性细胞比率显著增加，分别为(148.017±24.201、152.992±22.160)。 结论：磷酸二酯酶4抑制剂—咯利普兰可显著改善局灶性脑缺血再灌注损伤造成的学习记忆障碍，推测其作用机制与抑制损伤大鼠海马区PDE4活性有关：PDE4活性降低使环磷腺苷(cyclicAdenosinemonophosphate，cAMP)水解减少，结果导致细胞内cAMP水平升高，进而活化蛋白激酶A(PKA)，导致转录因子cAMP效应元件结合蛋白(CREB)活化，最终触发基因表达和随后的蛋白质合成，从而改善H/R损伤引起的学习记忆功能障碍；离体细胞实验表明咯利普兰对海马神经元及PC12细胞缺氧/再给氧损伤具有保护作用；磷酸二酯酶抑制剂—己酮可可碱可提高局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠海马DG区新生细胞的存活，这也可能是PDE抑制剂具有保护脑缺血再灌注损伤的药理作用机制之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分咯利普兰对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠学习记忆及海马PDE4活性的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

第二部分 咯利普兰对神经细胞缺氧／再给氧损伤的保护作用

1实验材料

2实验方法

3实验结果

第三部分 己酮可可碱对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠海马区新生细胞存活的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

讨论

结论

参考文献

综述PDE4抑制剂对Alzheimer's病引起的学业习记忆障碍的治疗作用

攻读学位期间成果

致谢

统计学审稿证明