肿瘤抑制基因PTEN过表达对体外培养的人气道平滑肌细胞增殖的影响

摘要

一.研究背景： 气道重塑是支气管哮喘基本特征之一，将气道炎症和气道高反应性联系起来。气道重塑指的是哮喘中发生于气道壁的结构改变，这些改变包括上皮细胞的增生和化生，上皮下纤维化，肌细胞增生和血管发生。而气道平滑肌细胞(airwaysmoothmusclecell，ASMC)是气道重塑的主要结构成分之一。哮喘时ASMC生物学特性发生很大变化，包括增生，肥大，迁移等，不仅使支气管对刺激的收缩反应更强烈，加重气道高反应性，而且增殖的ASMC使气道壁增厚，导致基础气道阻力增加和不可逆性气流阻塞的发生。遗憾的是，当前尚无可以阻止或逆转气道重塑和其对肺功能影响的有效治疗。因此迫切需要深入了解气道重塑时ASMC的增殖和迁移等机制，寻找抑制其增殖和迁移等的靶点，为寻找新的阻止甚至逆转气道重塑的药物提供理论和实验依据。 与张力蛋白和辅助蛋白同源，第10号染色体丢失的磷酸酶基因(phophataseandtensinhomologdeletedonchromosone10，PTEN)是近年来发现的一种新的抑癌基因，是至今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，对细胞的生长、增殖、分化、凋亡、黏附、迁移和血管生长等许多生物学行为有重要影响。随着研究的深入人们也发现其在非肿瘤性疾病，如：心肌肥大，高血压动脉粥样硬化，支气管哮喘哮等疾病中也发挥重要的作用。 已有的研究已经证实PTEN可以通过对P13K，ERK和FAK等通路的抑制来抑制肿瘤细胞，心肌和血管平滑肌等细胞的增殖，而这些通路同时也是介导ASMC增殖，迁移等的主要信号传导通路，PTEN对ASMC的增殖等是否也有类似地影响，目前尚无相关的报道。我们推断PTEN的过表达对HASMC可能也具有类似的抑制增殖作用。 二.研究目的： 通过携带野生型PTEN全长cDNA的质粒转染体外培养的人气道平滑肌细胞(HumanAirwaySmoothMuscleCell，HASMC)，实现PTEN的过表达，以空质粒转染和正常组作为对照，初步研究PTEN的过表达对HASMC增殖和细胞周期进展的影响。 三.材料和方法： 1、分离肺癌肺叶切除术患者切除的相对正常的肺组织中的小支气管，按照本实验室已经成熟的方法培养人气道平滑肌细胞，4～8代的气道平滑肌细胞用于实验。用抗平滑肌a-肌动蛋白单克隆抗体鉴定为人气道平滑肌细胞。 2、携带野生型PTENcDNA的质粒(p-WT-PTEN)和空载质粒(p-EGFP)转化入大肠埃希菌DH5a中扩增。氨苄青霉素筛选，挑选阳性克隆，摇菌，Omega公司无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，双酶切，及基因测序鉴定正确后，大量提取质粒，-20℃保存备用。 3、实验分组：将细胞分为3组：转染p-WT-PTEN质粒组(A组)、转染空载体p-EGFP组(B组)、正常对照组(C组)。参照Lipofectamin2000脂质体转染试剂盒步骤进行操作，倒置荧光显微镜观察转染效果。 4、MTS/PMS微量比色法检测各组HASMC的增殖。 5、各组细胞PI单染后流式细胞仪测定细胞周期分布。 6、Trizol提取总RNA，RT-PCR检测各组细胞PTENmRNA的表达。 7、免疫组化SP法检测转染后各组HASMCPTEN蛋白的表达并拍照。 8、所有原始数据以均数±标准差表示，应用SPSS11.5软件进行OneWayANOVA(LSD)统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。 四.结果： 1、ASMC未汇合之前多呈梭形或多边形，内有1-2个细胞核，可向细胞密度低的方向伸出一至数个足突。细胞汇合后部分区域细胞束状排列，呈典型“峰谷”状。对平滑肌细胞特异的a-肌动蛋白进行免疫细胞化学染色，免疫反应阳性产物呈棕黄色。传至第4代，平滑肌纯度为95％。 2、少量制备的质粒，经XbaⅠ和HindⅢ酶切后，琼脂糖凝胶电泳，可显示两条条带，分子量分别为5.4kb、1.3kb，与pGZdXZ和插入的PTEN基因的大小一致。提取的质粒送北京诺赛公司测序，测序结果经BLAST与Genebank序列完全相符。 3、倒置荧光显微镜下，见质粒成功转染ASMC，转染阳性细胞在荧光显微镜下发绿色荧光。 4、MTS/PMS法检测质粒转染对HASMCs增殖的影响，结果显示p-WT-PTEN转染组细胞的吸光度(OD490值)显著低于p-EGFP转染组和对照组(P<0.05)；而p-EGFP转染组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。 5、流式细胞仪检测质粒转染对HASMCs细胞周期的影响，p-WT-PTEN转染组G0/G1期细胞的比例显著大于空载体转染组与未转染组，S期及G2/M期细胞的比例显著少于p-EGFP转染组与对照组(P<0.05)，p-EGFP转染组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。 6、RT-PCR同时扩增p-WT-PTEN转染组，p-EGFP转染组和对照组PTENmRNA，结果显示p-WT-PTEN转染组PTENmRNA的表达显著比p-EGFP转染组及对照组PTENmRNA的表达增加。 7、转染48小时各组HASMCPTEN蛋白免疫组化结果显示，PTEN蛋白在p-WT-PTEN转染阳性HASMC胞浆和胞核均有明显表达，且胞核表达比胞浆多，而p-EGFP转染组和对照组仅见微弱的PTEN蛋白表达。 五.结论： 1、PTEN在HASMC中具有与在其他细胞中类似的抑制增殖的作用，外源PTEN的表达能够抑制HASMC的增殖和细胞周期进展，G0/G1期细胞的比例增大，而S期及G2/M期细胞的比例减少。 2、p-WT-PTEN成功转染体外培养地HASMC后，PTEN在mRNA和蛋白水平表达增加。

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