血红素加氧酶-1在糖尿病氧化应激中的作用研究

摘要

糖尿病在全球尤其是发展中国家的患病人数急剧增加，已成为严重危害人类健康的流行性疾病。由于糖尿病慢性并发症可引起失明、尿毒症、截肢等严重后果，已成为目前全世界共同关注的公共卫生问题，也是目前的防治重点和难点。目前对HO-1在糖尿病氧化应激中的作用及其机制尚未完全阐明，本课题拟从体内外实验两方面对HO-1在拮抗糖尿病氧化应激中的作用进行探讨，为寻求有效的拮抗糖尿病氧化应激的手段提供科学的依据。 第一章、 HO-1在高糖和AGEs致THP-1细胞氧化应激中的表达变化研究 目的： 1．探讨不同浓度葡萄糖、晚期糖基化终产物（AGEs）在不同刺激时间对THP-1细胞ROS产量的影响； 2．了解高糖和AGEs联合刺激对THP-1细胞氧化应激的影响； 3．了解HO-1在高糖和AGEs所致THP-1细胞氧化应激中的表达变化； 4．探讨p38MAPK信号通路是否参与了高糖和AGEs诱导的THP-1细胞HO-1表达。 方法： 1．细胞培养：采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，于37℃、5%CO2培养箱内传代培养人单核细胞株THP-1。 2．体外制备AGEs：将牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）与葡萄糖混合于37℃孵育60天，4℃透析24h以去除未结合的葡萄糖。 3．细胞ROS产量检测：分别用5、15、25mmol/L的GLU或25、50、100μg/mL的AGEs刺激细胞，分别于刺激0．5、2、6、24h后收集细胞，DCFH-DA荧光探针标记，流式细胞仪检测平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）。 4．细胞分组：分为4组，即15mmol/LGLU组（高糖组）、100μg/mLAGEs组（AGEs组）、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs组（高糖+AGEs联合组）及对照组。 5．细胞培养液上清TNFa水平检测：采用ELISA方法进行。 6．细胞培养液上清中MDA水平检测：采用硫代巴比妥酸法（thiobarbituric acid，TBA），严格按照试剂盒说明步骤检测。 7．RT-PCR法检测HO-1mRNA表达：提取总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），两步法进行RT-PCR，扩增产物于1．5%琼脂糖凝胶进行电泳。 8．免疫印记（western blot，WB）法检测HO-1蛋白表达：提取总蛋白，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），电转移至硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter，NC）封闭非特异位点。利用多克隆兔抗人HO-1抗体及HRP标记的二抗与NC反应，DAB显色后拍照分析条带亮度。 9．SB203580（SB，p38MAPK抑制剂）干预实验：分为高糖组、SB+15mmol/LGLU（SB+高糖）组、AGEs组、SB+100μg/mLAGEs（SB+AGEs）组。10μmo/LSB干预30min后换以含15mmol/LGLU或100μg/mL AGEs细胞培养液继续孵育24h，收集细胞进行RT-PCR检测HO-1mRNA表达水平。 10．统计学处理：用SPSS13．0软件对所有数据进行统计学处理；实验数据计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间资料比较用析因设计的方差分析（ANOVA），任意两组间比较采用独立样本的t检验，相关分析采用积矩相关系数（Pearson相关系数）分析，检验标准为α=0．05。 结论： 1．高糖和AGEs单独刺激能导致THP-1细胞氧化损伤加剧、分泌炎症因子TNFα水平及HO-1表达增高，二者联合刺激能使上述改变进一步加剧。 2．p38MAPK抑制剂对高糖和AGEs诱导的THP-1细胞HO-1mRNA表达无显著影响。 3．HO-1表达与细胞氧化损伤及炎症指标呈显著正相关，提示高糖和AGEs导致THP-1细胞氧化损伤及炎症反应，后者诱导HO-1表达适应性和代偿性增高，从而发挥细胞保护作用。 第二章、抑制HO-1对高糖和AGEs致THP-1细胞氧化应激的影响 目的： 探讨抑制HO-1表达对高糖和AGEs刺激下THP-1细胞氧化应激的影响。 方法： 1．细胞分组：分为4组，即对照组、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs（GLU+AGEs）组、ZnPP组及ZnPP+15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs（ZnPP+GLU+AGEs）组，其中对照组和ZnPP组THP-1细胞培养液的GLU浓度均为5mmol/L。 2．细胞ROS产量、细胞培养液上清中MDA及TNFa水平、HO-1mRNA及蛋白表达水平检测同第一章。 3．统计学处理：用SPSS13．0软件对所有数据进行统计学处理。实验数据计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间资料比较用析因设计的方差分析（ANOVA），任意两组间比较采用独立样本的t检验，检验标准为α=0．05。 结论： HO-1抑制剂ZnPP本身也能对THP-1细胞造成一定的氧化损伤，并引起HO-1表达增高，ZnPP预处理能显著抑制高糖和AGEs引起的HO-1表达增高，进一步加剧高糖和AGEs引起的细胞氧化损伤及分泌炎症因子TNFa的水平。 第三章、诱导HO-1对高糖和AGEs致THP-1细胞氧化应激的影响 目的： 探讨诱导HO-1高表达是否可对抗高糖和AGEs所致THP-1细胞的氧化损伤。 方法： 1．细胞分组：分为4组，即对照组、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs（GLU+AGEs组）、CoPP组、CoPP+15mmol/LGLU+100μg/mL AGEs（CoPP+GLU+AGEs组），其中对照组和CoPP组THP-1细胞培养液的GLU浓度均为5mmol/L。 2．细胞ROS产量、细胞培养液上清中MDA及TNFa水平、HO-1mRNA及蛋白表达水平检测同第一章。 3．统计学处理：用SPSS13．0软件对所有数据进行统计学处理；实验数据计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间资料比较用析因设计的方差分析（ANOVA），各组内均数比较采用独立样本的t检验或单向方差分析（One-way ANOVA），多重比较采用LSD法（Least-significant difference test）。检验标准为α=0．05。 结论： 在高糖和AGEs存在的情况下，HO-1诱导剂CoPP诱导HO-1蛋白表达增加，并显著抑制细胞氧化应激，明显减轻高糖和AGEs所致氧化损伤，而CoPP本身并不引起THP-1细胞氧化损伤和分泌炎症因子水平增加，结果提示诱导HO-1高表达可能是极具潜力的新的糖尿病慢性并发症的治疗靶点之 第四章、2型糖尿病合并慢性并发症患者的外周血单核细胞HO-1表达与氧化应激的相关性研究 目的： 1．了解初诊2型糖尿病（type2 diabetes mellitus，T2DM）合并慢性并发症患者外周血单核细胞HO-1的表达情况； 2．探讨初诊T2DM合并慢性并发症患者外周血单核细胞HO-1表达与氧化应激的相关性。 方法： 1．样本选择：来自我院内分泌代谢科门诊及住院的初次诊断T2DM的患者36例，健康志愿者10例。分为正常对照组、糖尿病无并发症组和糖尿病并发症组。 2．细胞收集：采集清晨空腹静脉抗凝血，Percoll法分离单核细胞。 3．细胞ROS产量、血清MDA水平及HO-1mRNA表达检测同第一章。 4．HO-1蛋白表达检测：采用免疫荧光法检测，将外周血单核细胞进行免疫荧光染色后，在荧光显微镜下观察HO-1在细胞内的表达情况。 5．统计学处理：用SPSS13．0软件对所有数据进行统计学处理；实验数据计量资料以均数±标准差（x±s）表示。两组间资料比较用独立样本的t检验，相关分析采用积矩相关系数（Pearson相关系数）分析，检验标准为α=0．05。 结论： 1．初诊T2DM患者的血糖、血清MDA、外周血单核细胞ROS产量及HO-1表达均显著高于正常对照组，提示初诊T2DM可能由于机体抗氧化防御机制的代偿性增高仍不足以对抗高血糖引起的氧化损伤，导致机体处于氧化应激状态。 2．并发症组的血糖水平、氧化应激指标及HO-1表达均显著高于无并发症组，提示高血糖及其引起的氧化损伤可能参与了初诊T2DM患者慢性并发症的发病机制，在排除BMI及血糖水平等因素的影响后，氧化应激指标仍与HO-1表达呈显著正相关，提示HO-1作为一种应激反应蛋白，在糖尿病所致氧化应激情况下代偿性表达增高，但仍不足以对抗该氧化应激。提示除严格控制血糖外，通过适当的手段诱导HO-1高表达将是极具潜力的糖尿病慢性并发症防治的新靶点之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一章HO-1在高糖和AGEs致THP-1细胞氧化应激中的表达变化研究

第1节材料

第2节方法

第3节结果

第4节讨论

第二章抑制HO-1对高糖和AGEs致THP-1细胞氧化应激的影响

第1节材料

第2节方法

第3节结果

第4节讨论

第三章诱导HO-1对高糖和AGEs致THP-1细胞氧化应激的影响

第1节材料

第2节方法

第3节结果

第4节讨论

第四章2型糖尿病合并慢性并发症患者的外周血单核细胞HO-1表达与氧化应激的相关性研究

第1节材料

第2节方法

第3节结果

第4节讨论

小 结

参考文献

发表论文

致谢

统计学证明