间充质干细胞联合骨髓细胞输注诱导大鼠胰岛移植免疫耐受

摘要

本文拟应用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）糖尿病大鼠模型进行同种异体胰岛移植，以供体来源的间充质干细胞联合骨髓细胞共同静脉预输注的方法，观察胰岛移植物的存活时间，了解间充质干细胞调节免疫反应过程，糖尿病大鼠胰岛移植物的存活时间及参与的淋巴细胞类型、细胞因子变化，为探索胰岛移植后免疫耐受的方法开辟多种途径。 课题分以下三个部分 一、大鼠间充质干细胞体外培养及免疫学特性的研究 目的：体外分离培养和纯化骨髓来源的间充质干细胞，研究其体外的生物学特性和对免疫细胞功能的影响及初步机制。 方法：①改良式单纯贴壁培养法分离培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞，观察获得各代细胞形态及细胞的生长曲线，流式细胞仪检测第三代细胞生长周期、细胞表面标记，诱导成骨和成脂肪分化。②间充质干细胞与脾淋巴细胞共同体外培养，检测共培养体系中淋巴细胞增殖、凋亡和淋巴细胞亚群的变化；检测共培养体系上清液中细胞因子的变化。 结果：①骨髓来源的间充质干细胞呈长梭形，贴壁生长，细胞周期G0～G1期占（81.8±2.8）%；流式细胞仪鉴定干细胞的标志阳性：CD44（99.83%）、CD90（99.67%）；造血干细胞的标志表达阴性：CD34（0.48%），白细胞共同抗原CD45（0.05%）及CD11b（0.1%）。成骨和成脂肪诱导可以使BM-MSCs出现钙盐沉积和脂滴，分化为成骨细胞和脂肪细胞。②骨髓间充质干细胞与脾淋巴细胞按不同比例共同培养：MSC：L（M/L）为1：1、1：10和1：50时，可以明显抑制同种异基因来源的淋巴细胞增殖，明显抑制共培养体系中CD8+T淋巴细胞的比例，但并不影响体系中CD4+T淋巴比例和淋巴细胞凋亡率。M/L为1：1时可以增加共培养体系中CD4+CD25/CD4+的比例。③上清液细胞因子检测显示INF-γ、IL-10及IL-6高表达，IL-2及TNF-α中度表达，IL-4、IL-1α、IL-1β低度表达。M/L为1：10和1：50组上清液IFN-γ水平下降；M/L1：10组上清液IL-6水平升高，而TNF-α水平下降。 结论：体外培养可以获得大量生物学特性均一的大鼠骨髓间充质干细胞，在体外具有抑制淋巴细胞增殖，调整T淋巴细胞亚群的作用，机制可能是通过部分细胞因子来实现。 二、骨髓间充质干细胞在异基因正常大鼠体内的分布和对活体免疫功能的影响 目的：研究骨髓间充质干细胞输注后在体内的分布情况和对活体正常同种异基因大鼠免疫功能的影响。 方法：①Wistar大鼠来源的骨髓间充质干细胞，CFSE染色后以5×106/只经尾静脉注入SD大鼠体内。分别在24小时、48小时、72小时、1周及2周处死受体大鼠，取脾脏、肺、肝脏进行冰冻切片，骨髓细胞涂片后荧光显微镜观察，以及流式细胞术分析骨髓间充质干细胞在体内的分布情况。②24只SD大鼠随机分为2组，实验组按5×106/只尾静脉注射骨髓间充质干细胞，对照组注射PBS。在注射后1，2，3，4周分别处死实验组和对照组大鼠各3只，取脾淋巴细胞行淋巴细胞增殖实验和单向混合淋巴反应（MLR）。③20只SD大鼠随机分为4组，每组5只，每只大鼠分别通过尾静脉注射5×106，5×105，5×104骨髓间充质干细胞及1mlPBS。10天后处死全部大鼠行单向混合淋巴细胞实验，流式细胞术分析大鼠外周血和脾脏淋巴细胞亚群的变化 结果：①注入细胞24小时、48小时，BM-MSCs细胞聚集以肺为主；72小时后细胞聚集以脾脏和骨髓为主。在1周时脾脏、肝脏及骨髓内仍然可以见到较多细胞；超过两周后逐渐消失。②在ConA刺激下，实验组大鼠的脾淋巴细胞可以正常增殖。在与SD大鼠来源的脾淋巴细胞进行MLR发现，实验组大鼠1周、2周的OD值与正常对照组相比有显著差异（P=0.000）。③不同浓度组的MLR结果表明，注射5×106细胞组脾淋巴细胞MLR受到抑制（P=0.000），外周血、脾脏CD4+T较对照组降低（P=0.014，P=0.009），外周血CD8+T较对照组降低（P=0.020），外周血和脾脏CD4+CD25+/CD4+均升高（P=0.009，P=0.006）。 结论：骨髓间充质干细胞在注射后短时间内滞留以肺为主，在1周～2周后在脾脏和骨髓。骨髓间充质干细胞的免疫抑制作用受时间限制，超过2周后作用消失；且在体内发挥作用要达到5×106以上，可以降低体内CD4+T细胞亚群水平，部分降低CD8+，升高CD4+CD25/CD4+百分率。 三、骨髓间充质干细胞联合骨髓细胞（BMC）输注诱导胰岛移植免疫耐受及其机制的研究 目的：骨髓间充质干细胞联合骨髓细胞共同静脉输注诱导胰岛移植免疫耐受的方法及作用机制，为寻找诱导胰岛移植免疫耐受的方法开辟新的途径，提供新的依据。 方法：①建立糖尿病动物模型：注射剂量按照35mg/kg·体重，连续5天。每周监测随机血糖3次，连续2周血糖超过16.7mmol/L以上者认为造模成功。②大鼠胰岛细胞的分离纯化：采用胶原酶P胰管灌注消化，Ficoll-400不连续梯度纯化Wistar大鼠胰岛；⑨嵌合体模型的建立：采用60Coγ射线全身照射，剂量为7Gy。全身照射（TBI）后4小时内经尾静脉输入BM-MSCs/和BMC。移植术后14天定量PCR检测嵌合率。④间充质干细胞联合骨髓细胞输注对糖尿病胰岛移植物的影响：以雄性Wistar大鼠为骨髓间充质干细胞供体，雌性Wistar大鼠为骨髓细胞供体，雌性SD大鼠为胰岛移植受体。将糖尿病SD大鼠随机分为单纯胰岛移植（A组）、单纯骨髓间充质干细胞5×106预输注后胰岛移植组（B组）、骨髓间充质干细胞5×105+骨髓细胞1×107预输注后胰岛移植组（C组）及骨髓间充质干细胞5×106+骨髓细胞1×107预输注后胰岛移植组（D组）四组。各组在预处理7天后行胰岛移植，将1000IEQ的胰岛细胞移植入各组糖尿病大鼠的左肾包囊内，比较各组移植物生存时间上的差异。同时各实验组分别在预处理后第7天（即胰岛移植术前）、胰岛移植术后7天、14天、21天、排斥后应用放射免疫法测定大鼠血清胰岛素水平。D组大鼠在不同的移植时期（包含血糖正常期、排斥期两个时期）手术将移植物载体肾取出；其余各实验组在糖尿病SD大鼠移植物排斥后2天，取出其移植物载体肾，做病理切片观察。⑤对胰岛移植糖尿病大鼠混合淋巴细胞反应的影响：D组分别于移植耐受期和排斥后取大鼠脾脏，分离淋巴细胞，与丝裂霉素C处理的供体Wistar大鼠和无关第三品系F344/N大鼠脾淋巴细胞进行单向混合淋巴细胞培养，MTT法观察受体淋巴细胞增殖反应。⑥供体间充质干细胞联合骨髓细胞输注对胰岛移植糖尿病大鼠T淋巴细胞亚群及CD4+CD25+T细胞的影响：将糖尿病SD大鼠按上述方法分组，各组分别于预处理后第7天（即胰岛移植术前）、胰岛移植术后7天、14天、排斥后取外周血及大鼠脾脏制备的淋巴细胞悬液，应用流式细胞仪检测CD8+、CD4+、CD4+CD25+/CD4+T淋巴细胞比率。⑦骨髓间充质干细胞联合骨髓细胞输注对胰岛移植糖尿病大鼠细胞因子微环境的影响：各组分别于预处理后第7天（即胰岛移植术前）、14天、排斥后取外周血清，应用Luminex多功能流式点阵仪液相芯片法检测白介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）含量；同时应用酶联免疫吸附法检测外周血清转移生长因子-β1（TGF-β1）含量。 结果：①以STZ（35mg/kg·体重）多次小剂量经腹腔注射的方法，可成功诱发SD大鼠糖尿病，糖尿病模型建模成功率为98%；②胰岛细胞获取量及细胞活率：每条大鼠胰腺分离、纯化后平均可获取的胰岛细胞团数量为（1063.49±84.74）IEQ，纯度>90%。胰岛素释放试验：低糖组的胰岛素释放量为（2.08±0.56）μIU/Islet，高糖组的释放量为（7.18±1.32）μIU/Islet。③14天时检测外周血Y染色体含量检测，提示只有D组外周血中含有少量的Y染色体，其余两组均未检测到。在骨髓、脾脏组织中，三组之间Y染色体含量有差异（P=0.027，P=0.039）D组的含量最高。④D组大鼠胰岛移植物生存时间与其它三组比较具有显著性差异（P=0.000），中位生存时间为30天，最长达32天。C组移植物生存时间也有所延长，中位生存时间为14天。 结论：①采用胶原酶P胰管灌注消化，Ficoll-400不连续梯度纯化能分离、纯化出较大数量且功能良好的大鼠胰岛细胞。②骨髓间充质干细胞5×106+骨髓细胞1×107能显著延长同种异体大鼠胰岛移植物的存活时间。③以单向混合淋巴细胞培养实验证实，预输注供体骨髓间充质干细胞5×106+骨髓细胞1×107的受体鼠淋巴细胞对供体淋巴细胞刺激的增殖反应具有明显抑制作用。④嵌合体检测表明预输注供体骨髓间充质干细胞5×106+骨髓细胞1×107的受体鼠在血液、脾脏和骨髓形成嵌合体，可能是诱导免疫耐受的机制之一。⑤骨髓间充质干细胞5×106+骨髓细胞1×107预输注能显著降低胰岛移植糖尿病大鼠外周血CD4+T细胞比例。⑥供体骨髓间充质干细胞5×106+骨髓细胞1×107预输注可使胰岛移植糖尿病大鼠血清IL-2、IFN-γ呈现较低水平，而显著升高IL-4、TGF-β1水平，IL-6则无明显改变，提示供体骨髓间充质干细胞联合骨髓细胞输注诱导胰岛移植免疫耐受可能包含调节Th1/Th2，纠正免疫偏离的作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一章 大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及免疫学特性

1实验材料

2 Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(BM—MSCs)分离、培养

3大鼠BM-MSCs免疫学特性的观察

4统计学分析

5结果

6讨论

7小结

参考文献

第二章BM—MSCs在异基因正常大鼠体内的分布和对活体免疫功能的影响

研究一BM-MSCs在异基因大鼠正常体内的分布

1实验材料

2实验方法

3.统计学分析

4.结果

5.讨论

参考文献

研究二BM-MSCs对正常异基因大鼠体内免疫功能的影响

1实验材料

2实验方法

3.统计学分析

4.结果

5.讨论

6.小结

参考文献

第三章 间充质干细胞联合骨髓细胞输注诱导胰岛移植免疫耐受及其机制的研究

1.实验材料

2.实验方法

3.统计学分析

4.结果

5.讨论

6.小结

参考文献

结 论

问题与展望

攻读学位期间成果

附录：缩略词表

致 谢

文献综述：间充质干细胞与糖尿病治疗进展

研究生毕业论文统计学审稿证明