联合检测肝癌肿瘤标志物对肝细胞肝癌的诊断和预后的价值

摘要

第一部分:AFP、CEA和CA199联合检测在肝癌中的诊断价值 研究背景: 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床上最常见的恶性肿瘤之一，以其高发病率和高度恶性行为著称，预后差，曾经被称为“不治之症”。后来随着诊疗技术的不断发展，虽然治疗及预后情况有所好转，但死亡率仍然高居不下，在我国占癌症死亡率的第二位。肿瘤切除或肝移植是目前治疗该病的最有效手段，但是由于不能早期做出正确的诊断以及术后有较高的复发、转移率，严重影响了治疗的效果。产生这种结果的主要原因是由于肝脏具有强大的代偿机制，在疾病的早期常无任何症状，而且肝脏富含血液，有发达的血管网，为肿瘤细胞的转移提供了温床。多数肝细胞肝癌的患者在就诊时已经发生了转移，只不过以目前的检测手段不能发现，这就是所谓的微转移。微转移是指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，肿瘤细胞播散于淋巴系统、血液循环、骨髓、肝、肾、肺等组织、器官中，形成微小转移灶，常无任何临床表现[1]。1993国际抗癌联盟（UICC）在《肿瘤TNM分期补充材料》中指出，微小肿瘤转移灶生长至直径1-2mm时，称作微转移。在肿瘤转移的形成过程中，肿瘤细胞在到达远处器官之前一般必先存在血液循环中，然后才能达到远处的组织、器官，并最终发生转移。虽然并非所有循环中的癌细胞均能存活，但循环系统中癌细胞阳性与肿瘤患者的复发和不良预后密切相关，是比传统的预测方法更好的独立预后因素[2、3]。外周血作为肿瘤细胞转移的载体，是血行转移的必要条件，部分肝癌病人在肝癌切除或肝移植前，已有肿瘤细胞脱落并进入血液循环系统中，入血的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是导致肝癌术后复发和转移的首要条件。因此，检测循环肿瘤细胞对判断肝癌的转移复发、指导临床治疗具有重要意义。大量的临床研究已经证实[4]：存在微转移的肿瘤患者术后复发转移的风险增加，整体的生存率下降，预后不良。因而如能早期发现肝细胞肝癌，并能预测其转移性，指导临床治疗，必将提高肝癌患者的治疗效果和生存率。早期发现肝癌的方法主要是检测肿瘤标志物，在外周血中作为检测肝细胞肝癌标志物的各项指标中，AFP作为肝癌的特异性指标，具有重要的意义，已经得到广泛的应用和认同，是确诊原发性肝癌的重要诊断指标，对肝癌的诊断价值仅次于病理诊断[5]。但是其阳性率较低，一般只能达到50-70%，很容易造成漏诊。CEA是具有人类胚胎抗原决定簇的酸性蛋白，在胚胎早期由内胚层衍生而来，胃肠道及肝胰都可合成CEA，并且成年胃肠道也能合成CEA并分泌入肠腔。消化道肿瘤细胞因极性消失，CEA返流入淋巴或血液，导致血清CEA增高，其在多种肿瘤中都有表达，被认为是一种最广泛应用的人类肿瘤相关抗原。CEA在原发性肝癌中很少高表达，但在继发于消化道的肿瘤的肝癌中表达明显增高。CA199是一种由消化道肿瘤细胞株所分泌的低聚糖类抗原，在消化道肿瘤患者血清中其浓度可明显升高，而正常人血清中CA199的水平很低。有研究显示[6]：CA199对胰腺癌有重要的诊断价值，对原发性肝癌的诊断也有一定价值。这些指标已经在临床中作为一种基本的肿瘤辅助诊断方法广泛应用，其在肝癌中的应用价值也进行了大量的研究。 目的和意义: 通过联合检测肝细胞肝癌患者和对照组的血清AFP、CEA、CA199水平，探讨其在肝细胞肝癌中的诊断价值和意义。 材料和方法: 以肝细胞癌患者30例作为实验组，另以胆囊结石患者或外伤等良性非肿瘤性患者35例作为对照组，分别于清晨空腹收集各个研究对象的外周静脉血2ml，检测血清中AFP、CEA和CA199水平，对结果进行分析，以期发现传统的肿瘤标志物在原发性肝癌中的诊断价值。 结果: 在肝细胞肝癌患者中，AFP的阳性表达率达到66.7%，和对照组比较阳性率的增高有显著性意义（P<0.05）； CEA则没有发现有阳性表达；CA199虽有一定的阳性表达，但是阳性率明显偏低，只有6.7%，和对照组比较差异没有显著性意义（P>0.05）。联合检测的阳性率可以提高到70%。 结论: AFP作为HCC的诊断标志物，具有较高的特异性和阳性率，同时阴性率也达到较高的比例。CEA在HCC中没有表达，对其没有诊断的价值，利用这个特点可以和转移性肝癌鉴别。CA199在HCC中阳性率很低，失去其诊断的价值。三者联合检测不能明显提高诊断的阳性率，参考意义不大，仍应以AFP作为诊断的标准。 第二部分:联合检测外周血AFPmRNA、h-TERTmRNA和CD44mRNA对肝癌诊断和预后的价值 荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）技术是近年来发展起来的一项新的分子检测技术，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。FQ-PCR的应用使在外周血中检测mRNA变为现实，其能在106-7个单核细胞中分离检测出一个肿瘤细胞，故而能够早期发现肿瘤和微转移，改善对循环肿瘤细胞检测的敏感性及特异性。 目的和意义: 本研究以肝细胞肝癌患者为研究对象，应用荧光定量PCR技术，联合检测外周血循环中的肿瘤标志物AFPmRNA、CD44V6mRNA和hTERTmRNA的含量，并与对照组进行分析、比较，结合临床资料，探讨它们在HCC诊断和预测预后的价值，期望能够对肝癌临床有一定的指导意义。 材料和方法: 以肝细胞肝癌患者30例作为实验组，分别在不同的时段检测肿瘤标志物进行相应的实验研究；另以胆囊结石患者或外伤等良性非肿瘤性患者作为对照组，分别于清晨空腹收集各个研究对象的外周静脉血约3ml，利用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，提取总RNA，而后反转录为cDNA。分别根据GenBank的基因序列，设计AFP、CD44V6和hTERT的mRNA引物，利用实时定量系统进行荧光定量分析。根据不同时段的相应结果进行不同的分析：1、采用术前联合检测AFPmRNA、端粒酶mRNA和CD44mRNA，对原发性肝癌诊断的可行性进行分析；2、采用术后联合检测AFPmRNA、端粒酶mRNA和CD44mRNA，对预后进行有效判断，指导术后综合治疗，提高患者生存率和降低复发率；3、试图找出能够准确预测肿瘤微转移和复发的预测指标。 结果: 在肝细胞肝癌患者中，外周血中的AFPmRNA、hTERTmRNA和CD44V6mRNA的阳性率分别为76.7%、83.3%和60.0%，和对照组比较差异具有显著性意义（P<0.05），是诊断原发性肝癌的比较理想的肿瘤标志物。单一检测其中的一种标志物，其阳性率较低，临床意义相对稍差。如果同时联合检测三项指标，则敏感度提高到96.7%，其特异度为97.1%，成为诊断原发性肝癌的优良指标。术后检测此三个指标，可以监测肿瘤细胞在体内存留情况，成为预测转移、复发的有效手段。通过进一步和肝癌患者临床、肿瘤局部资料等数据的比较、分析发现，肿瘤包膜是否完整、有无肝内浸润和（或）转移与这些肿瘤标志物的表达具有相关性（P<0.05）；而与外周血AFP的表达无显著相关性（P>0.05）。对于Ⅲ期以上的患者，其AFPmRNA和hTERTmRNA的表达100%阳性。 结论: 在外周血中定量检测AFPmRNA、hTERTmRNA表达情况可以作为诊断原发性肝癌的指标，甚至可以发现其它检测方法无法发现的小肝癌或隐性肝癌，同时能够有效的预测肿瘤的复发和转移，对患者的预后和术后采取相应的措施提供了有效的依据。分析结果也提示：外周血AFPmRNA、hTERTmRNA和CD44V6mRNA的检测是很好的诊断肝癌和预测转移、预后的方法，而且联合检测比单一检测的意义更为明显。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

前 言

第一部分联合检测AFP、CEA和CA199对肝细胞癌的诊断价值

1材料和方法

2 结果

3讨论

4结论

第二部分联合检测外周血AFPmRNA、h-TERTmRNA和CD44V6mRNA对肝癌诊断和预后的价值

1材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

全文总结

参考文献

附 图

致谢