Syndecan-1与炎症性肠病发病机制关系的初步探讨

摘要

研究背景与目的： 炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）是一种病因尚不明确的慢性非特异性肠道炎性病变，包括溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）和克罗恩病（Crohn's Disease，CD），是胃肠道最为严重的疾病之一。该病常突发起病，多数病程缓慢，有反复发作的倾向，少数病例呈急性暴发，病情凶险，病程较长者亦被认为结肠癌的癌前病变，世界卫生组织将其列为难治性疾病之一。该病在我国发病率比较低，但近年来有大幅增加的趋势。目前认为IBD的发病机制为：环境因素作用于遗传易感者，在肠道菌丛的参与下，启动了肠道免疫及非免疫系统，最终导致免疫反应和炎症过程。但是始终未找到一种特定微生物和IBD恒定相关。 Syndecans是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，包含有硫酸乙酰肝素（HS）及硫酸软骨素链修饰的Ⅰ型跨膜核心蛋白。硫酸乙酰肝素链能与许多对血管修复、血管发生及免疫细胞生长及细胞-细胞、细胞-细胞外基质间黏附起调节作用的配体如许多生长因子、细胞因子、趋化因子和细胞外基质等相互作用。Syndecans主要包括四个成员，其中Syndecan-1（CD138）是上皮细胞包括血管内皮细胞的主要Syndecans成员。Syndecan-1携带的HS侧链可结合一系列配体如细胞粘附分子、细胞外基质成份、生长因子及细胞因子等，以共受体方式调节细胞与细胞、细胞与微环境之间的相互作用，参与细胞粘附、组织分化、血管形成及宿主防御等诸多生理病理过程的调节。 关于Syndecan-1和肿瘤关系研究比较多，但是在炎症方面却是近几年才开始受到重视，国内罕见报道。Syndecan-1胞外段可在脱落酶（sheddase）作用下从细胞表面水解脱落形成可溶性效应分子并被吸收入血。Syndecan-1的胞外段HS链，是其主要功能部位，能与炎症过程中的众多的粘附分子、细胞外基质成分、细胞因子、趋化因子等结合，在炎细胞的滚动、贴壁、黏附、游出等步骤中发挥作用，因此可认为，Syndecan-1与炎症过程关系密切。在Syndecan-1基因敲除（Sdc1-/-）小鼠中，生长及发育均无异常。但是在绿脓杆菌的攻击下，Sdc1-/-小鼠明显耐受感染，表现出显著下降的细菌定植力及明显减轻的肺部炎症和死亡率，说明Syndecan-1促进了感染性炎症的发生。Syndecan-1还参与细胞-细胞外基质的粘附。介导细胞粘附到胞外基质蛋白的主要受体为整台素家族受体，但胞外基质蛋白还具有结合糖胺聚糖的能力，尤其是硫酸乙酰肝素。细胞能利用整合素和Syndecan-1双受体来介导细胞-细胞外基质的粘附。 而在炎症的研究中，国外就肺炎与Syndecan-1的关系研究较多。在肺炎中，已证实MMP-7可导致Syndecan-1的脱落，形成的可溶性Syndecan-1与中性粒细胞趋化因子KC结合，动员KC形成趋化梯度，吸引中性粒细胞，促进肺炎的发生。但是关于Syndecan-1和肠炎之间的关系罕有报道。我们的前期研究发现，Syndecan-1在IBD模型小鼠肠上皮细胞表面的表达明显减低，而血清中游离Syndecan-1明显增加，提示IBD与Syndecan-1脱落增加相关。有研究提示Syndecan-1表达缺失或破坏时可造成肠上皮屏障功能受损，导致蛋白丢失，分泌性腹泻及营养障碍等，而在IBD患者的再生粘膜中也存在Syndecan-1的表达缺失，从而影响黏膜的愈合。另外，Syndecan-1似乎也和各种细胞因子有相互作用。Day RM等证实促炎因子TNF-α，IL-1β对肠上皮细胞中Syndecan-1的表达起下调作用，可能机制为通过使Syndecan-1的外功能区的脱落增加而引起肠道的炎症反应。 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌细胞壁主要成分，也称为内毒素，在感染和炎症中起着至关重要的作用。鉴于Syndecan-1与炎症及感染关系密切，而肠道非特异性炎症亦和感染有重要关系。基于以上背景，我们推测，肠道细菌可能通过影响Syndecan-1的表达来参与肠道非特异性炎症的过程。因此我们通过与细菌感染密切相关的促炎因素TNF-α和LPS刺激肠上皮细胞，观察不同剂量刺激物对Syndecan-1表达的影响，为Syndecan-1在肠炎发生发展中的作用机制提供重要线索，研究内容包括： 1、Syndecan-1在不同疾病患者肠粘膜组织及不同肠上皮细胞系中的表达; 2、不同剂量TNF-α刺激下Syndecan-1在肠上皮细胞的表达变化; 3、不同剂量LPS作用下肠上皮细胞及细胞培养上清中Syndecan-1的变化; 4、不同剂量LPS刺激下肠上皮细胞粘附力的改变; 方法: 1、免疫组化法检测IBD、结肠腺瘤及结肠腺癌患者肠粘膜组织中Syndecan-1的表达。 2、流式细胞仪分析不同肠上皮细胞株，筛选出Syndecan-1表达量高的SW480细胞用于后续实验。 3、免疫荧光染色法检测不同剂量TNF-α刺激SW480细胞后，Syndecan-1表达变化。 4、免疫荧光染色法检测不同剂量LPS作用SW480后Syndecan-1表达变化。 5、Dot-blot检测各组细胞和培养上清Syndecan-1蛋白水平的变化。 6、细胞计数法检测不同组粘附力改变。 7、统计学处理：采用SPSS13．0软件进行统计学分析，数据以x±S表示，进行单向方差分析；Dot-blot结果进行多个独立样本的非参数检验；P<0．05认为差异有统计学意义。 结果: 1、Syndecan-1在肠粘膜组织中的表达：在不同疾病肠粘膜组织中，Syndecan-1表达有明显差异。在IBD患者肠粘膜组织中，上皮细胞表面表达减少，间质表达增多，血清中游离Syndecan-1水平明显升高。而在低分化腺癌中，Syndecan-1表达呈缺失状态。 2、Syndecan-1在不同肠上皮细胞的表达：SW480细胞高表达Syndecan-1分子，HT-29细胞表达少量Syndecan-1分子，Lovo细胞基本不表达Syndecan-1分子。 3、不同浓度TNF-α作用下SW480细胞表达Syndecan-1的趋势变化：随着TNF-α浓度增加，Syendecan-1的表达荧光强度由强渐弱。TNF-α对Syndecan-1表达呈剂量依赖性。各组间F=73．498，P＝0．000，差异有显著性意义。进一步做多重比较对照组（0ng/ml组）和2．5ng/ml组的差别无统计学意义，（P=1．000），而其他的各组间差异均有显著统计学意义（P=0．000）。 4、不同浓度LPS作用下SW480表达Syndecan-1的趋势变化：在未加LPS组（即0ng/ml组），可见Syndecan-1膜表达明显，随着浓度增加，荧光减弱，到104ng/ml组，荧光几乎不能检测，可见LPS对Syndecan-1表达的影响呈剂量依赖性。各组间F=106．300，P=0．000，差异有显著性意义。进一步做多重比较103ng/ml组和104ng/ml组的差别无统计学意义，（P=0．066），而其他的各组间差异均有显著统计学意义。0ng/ml组vs10ng/ml组，P=0．003；0ng/ml组vs其他组，P=0．000。 5、不同浓度LPS作用下肠上皮细胞Syndecan-1脱落的变化：随LPS浓度增加，细胞培养上清中Syndecan-1蛋白呈逐渐增多趋势，处理组IOD比值高于对照组，各组间差异有显著性意义，X2=12．321，v=4，P=0．015。104ng/ml组上清中蛋白表达量最高，103ng/ml组和102ng/ml组次之。 6、不同浓度LPS作用后肠上皮细胞同质粘附力改变：随着LPS剂量的递增，细胞与细胞之间粘附力下降。各组间F=264．364，P=0．000，差异有显著性意义，进一步做多重比较。对照组（即未加LPS组）和10ng/ml组的差别无统计学意义，（P=0．984），而与其他的各组差异均有显著统计学意义（P=0．000） 结论: 1、在IBD患者的肠粘膜组织中，Syndecan-1蛋白在膜表达较正常减低，而间质表达增多，血清中游离Syndecan-1较正常对照组明显增多，表明Syndecan-1脱落增加与IBD发生相关。 2、促炎因子TNF-α和细菌内毒素LPS对肠上皮细胞Syndecan-1表达呈剂量依赖性，随着TNF-α和LPS浓度增高，肠上皮细胞表面Syndecan-1表达减少，而肠上皮细胞培养上清中游离Syndecan-1逐渐增加，说明细菌感染和促炎因子可促进Syndecan-1的脱落。 3、LPS刺激后，肠上皮细胞粘附力亦随之下降，并呈剂量依赖性。 4、肠道细菌和炎症因子可能通过增强Syndecan-1的脱落而促进IBD的发生。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词对照表

声明

前言

第一章Syndecan-1在不同肠粘膜组织中表达变化及其意义

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二章TNF-α作用下肠上皮细胞Syndecan-1表达变化

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

第三章脂多糖作用下肠上皮细胞Syndecan-1表达变化

引言

材料与方法：

结果

讨论

小结

全文总结

参考文献

攻读硕士学位期间成果

致谢

统计合格证明