炎症因素对心房纤颤发病的预测作用及其与心房纤颤高凝状态和心肌重构的关系

摘要

研究目的： 心房纤颤（房颤）是一种最常见的心律失常，由于其可以造成心排量减少、心室率过快过慢，可加重心肌缺血及恶化心功能，并且可引起左房血栓形成和全身栓塞并发症（其中脑栓塞形成发病率高），极大地威胁人民健康，造成了巨大的社会经济负担。 本研究的主要目的包括：中国人TNF-α启动子区SNPs位点基因型的分布特点，研究房颤发病是否伴发明显的炎症标记物的变化，研究决定炎症上游因子TNF-α表达效率的基因启动子区各SNP位点不同基因型在房颤患者与非房颤对照个体分布情况是否不同，研究房颤发病的预测因子、尤其是不同基因型是否预示房颤发病风险高低；研究房颤本身是否伴发高凝状态和血小板激活，研究高凝状态和血小板激活可能的影响因素，尤其是炎症因素在这个过程起何种作用；研究特发性房颤和孤立性房颤内皮功能、凝血功能和血小板功能的变化特点及对抗栓治疗方案的指导；研究房颤患者本身引起的心脏、特别使双心房形态学改变及其与炎症因素的相互关系。 研究方法： 入选房颤患者102例（作为研究组）和性别、年龄和危险因素匹配的对照组个体117例。房颤通过心电图或入院诊断进行确认。排除标准包括：高龄，合并明显动脉硬化性疾病，先心病、风心病、心肌病、左室肥厚和心功能不全、等器质性心脏病，糖尿病，慢性炎症性疾病，结缔组织疾病，60天内手术史和急危重症，肿瘤和重要器官功能衰竭。 详细记录患者病史（尤其是房颤发病时间和特点）、体检情况（重点进行血压测定、心脏体检（包括心率、节律和脉率等各项和身高、体重、腹围等）、临床检验（常规化验、血生化指标、血凝血指标和炎症指标等）和临床检查结果（常规胸片、心电图和心脏超声等检查结果）。血脂、血糖、血肝肾功能等指标采用酶法测定，血纤维蛋白原（Fib）、部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和凝血时间等采用酶法测定，血电解质测定采用电解质分析仪直接电极法、血CRP测定采用免疫浊度法、甲状腺功能测定采用放射免疫法。心脏超声检查常规测量包含以下指标：左房前后径（LAd）、右房上下径（RAd）、室间隔收缩期厚度（IVSd）、二尖瓣返流程度（MR）和左室射血分数（LVEF）。患者组进行射频消融治疗者在术前72小时进行经食道心脏超声检查。 留取研究对象的全血和血清标本，部分标本用于临床送检，全血标本用于基因组DNA提取，血清冷冻于-70℃低温冰箱整批用于TNF-α、P-Selectin和vWF等细胞因子的检测。 全血基因组DNA提取采用德国QIAGEN全血DNA小量提取试剂盒（QIAamp（）DNA Blood Mini Kits）提取，主要步骤包括细胞裂解、过柱吸附、杂质洗涤和DNA洗脱。采用琼脂糖凝胶电泳方法确定DNA质量，并采用光密度比对法确定其浓度。 使用Prime Premier5软件设计TNF-α启动子区目的片段引物，并交公司进行合成。采用PCR方法（美国Promega PCR扩增试剂盒GoTaq（）PCR Core SystemsⅠ）扩增基因组DNA的TNF-α启动子区目的片段，主要步骤包括变性、退火和延伸，并反复进行多个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并与DNA marker进行比对，确认片段长度约为808bp。产物送公司进行专业纯化和核酸测序。测序结果使用Chromas软件进行读图，使用Pubmed网站Blast功能进行比对，确定每个个体基因型，尤其是各SNP位点的基因型。 血清细胞因子检测采用免疫酶联吸附分析方法（ELISA）检测，其中血清TNF-α检测采用美国R&D公司TNF-αELISA检测试剂盒（Human TNF-α/TNFSF1AImmunoassay Kit），可溶性P-选择素（sP-Selectin）检测采用武汉博士德公司P-Selectin检测试剂盒（Human P-Selectin ELISA Kit），血管病性假血友病因子（vWF）检测采用上海太阳生物技术有限公司血管性血友病因子（vWF）含量测定试剂盒。主要步骤包括：结合抗原（样本）、结合酶标抗体、洗涤、加底物显色、终止反应并在酶标仪上进行光密度读数。使用软件Curve Expert1.3对各指标进行标准曲线制作和标本光密度读数-浓度转换。 统计学分析采用SPSS13.0软件进行，计量资料行正态性检验，正态性检验采用单样本K-S拟和优度检验（1-Sample K-S Test）。如符合正态分布，数据用x±S表示；如不符合正态分布，数据用中位数（median）（四分位数间距，IQR）表示。对于显著偏态分布的资料，进行对数转换后再进入协方差和回归分析。 两组正态分布的计量资料均数比较采用Student t检验，两组中有一组以上是非正态分布的计量资料均数比较采用Mann-Whitney U检验。两组计量资料均数比较同时要控制其他对应变量有影响的因素时采用协方差分析，将可能有影响的因素作为协变量。计数资料表示为率，两个率的比较采用卡方检验（Fisher's Exact Test）。两组正态分布资料相关分析采用Pearson相关；对于非双变量正态分布资料的相关分析，采用Spearman相关。两变量相关分析同时控制其他因素对这种相关关系的影响时采用偏相关分析，将其他因素作为控制变量。 房颤独立预测因子估计采用logistic回归分析，房颤分组作为应变量，其他房颤组与对照组比较差异显著性P<0.20的变量以及性别、年龄等一般情况纳入作为自变量。-308G/A不同基因型房颤风险推测采用卡方检验的“risk estimate”。重要的研究指标（包括炎症促凝指标Fibrinogen和sP-Selectin）的影响因素估计采用多元回归分析，将这些指标分别作为应变量，将性别、年龄、分组及单因素相关分析中分别与这些应变量相关关系显著性P<0.20的计量变量和不同分组应变量指标差异显著性P<0.20的分类变量作为自变量。 研究结果： TNF-α启动子区检测片段内-851、-575、-419和-244四个SNP位点未检测到少见基因型（或少见碱基）。 房颤组和对照组的各项血液指标相比显示房颤组和对照组血TNF-α（pg/ml）的浓度分别为3.84（3.07，4.49）和2.85（2.28，3.60），相比有显著性差异（P<0.001）； 阵发性房颤患者和对照组血Fib水平分别为3.20±0.84和2.77±0.60 g/L（P=0.005），阵发性房颤患者和对照组血血sP-selectin水平分别为26.2±5.9和21.5±3.9 ng/mL（P<0.001）。协方差仍然提示阵发性房颤Fib和sP-selectin水平分别较对照组显著增高。 房颤组和对照组心动过缓发生率分别为29.7%和6.8%，相比有显著性差异（P<0.001）。 -308GG与-308non-GG个体血TNF-α浓度分别为3.37（2.72，4.44）和3.36（2.83，4.16），两者相比无显著性差异（P=0.600）。 Logistic回归分析显示，TNF-α、sP-selectin和LAd均是房颤的独立预测因子，其OR值分别为1.375（95%CI：1.024-1.846，P=0.035）、1.248（95%CI：1.121-1.389，P<0.001）和1.321（95%CI：1.125-1.552，P=0.001）。 炎症因素（TNF-α或CRP）与促凝血因素（sP-Selectin或Fib）之间均有显著的正相关关系，尤其是CRP与Fib之间的相关系数为0.560（P<0.001）。 多元回归分析表明，分组因素（是否房颤）标准回归系数为0.446（P<0.001），显示对血清sP-Selectin水平有显著性影响。 研究结论： 1.本研究未发现研究人群在-851、-575、-419和-244四个SNPs位点出现少见碱基。 2.首次发现房颤患者在TNF-α启动子区-308位点少见基因型携带率显著增高，并首次证实-308A携带者预示患房颤风险更高，提示TNF-α基因多态性影响房颤的易患性，支持炎症因素作为房颤发病的病因之一。 3.发现炎症标记物TNF-α、血小板功能标记物sP-selectin和左房大小标志LAd为房颤发生的独立预测因子，支持炎症因素在房颤的发病过程起作用。 4.证实房颤时存在凝血功能激活。血Fib水平的显著影响因素包括房颤发生率、性别、年龄和炎症因素。房颤、女性、高龄和高炎症水平提示高血Fib水平。首次发现炎症因素对房颤患者凝血指标有显著性影响。 5.证实房颤时存在血小板功能激活，未发现炎症因素对其有显著性影响。 6.证实阵发性房颤发作间歇期有明显的高凝状态和血小板激活。 7.特发性房颤患者凝血功能和血小板功能激活，孤立性房颤患者凝血功能无明显激活，但血小板功能显著激活。提示房颤可独立引起凝血和血小板功能激活。 8.房颤时左右房直径均显著增大，首次专门对房颤右房的形态学变化做了研究，未发现炎症因素对房颤心房重构过程有显著性影响。 9.持续性房颤炎症标记物水平增高和心房直径扩大的程度超过阵发性房颤，提示房颤负荷越大、炎症激活和心房扩大越严重。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前 言

第一节房颤与炎症

心脏外科手术后房颤

组织学证据

炎症标记物证据

相关关系还是致病因素?

治疗学证据

第二节TNF-α与房颤

TNF-α与心肌损害

TNF-α与房颤

TNF-α与 SNP

第三节房颤、内皮功能减退和促血栓形成

房颤与内皮功能减退

房颤与促血栓形成状态

第四节炎症与促血栓形成

第二章对象与方法

第一节病例选择、病史采集、标本留取和临床检验检查

病例选择

病史采集

静脉血留取和送检

临床检查

第二节实验主要试剂和仪器

主要试剂

主要仪器

第三节实验方法和过程

全血基因组DNA提取过程

TNF-α启动子区目的片段的PCR扩增

PCR产物电泳验证

PCR产物纯化和测序

血清TNF-α、sP-Selectin和vWF ELISA检测

第四节统计学分析

第三章研究结果

第一节全血DNA提取

第二节TNF-α启动子区PCR扩增

第三节TNF-α启动子区测序结果

第四节ELISA方法检测血清TNF-α、sP-Selectin和vWF水平

1血清TNF-α检测标准曲线

2血清sP-Selectin检测标准曲线

3血清vWF检测标准曲线

第五节SPSS统计学分析结果

1研究人群基本情况

2房颤组与对照组SNPs基因型分布比较及SNPs基因型与房颤风险估计

3房颤组与对照组血液指标比较

4阵发性房颤患者血内皮功能和促凝指标的变化

5房颤组与对照组超声学指标和心动过缓发生率比较

6各位点不同基因型之间血液炎症凝血指标差异性分析

7房颤预测因子的估计

8炎症与促凝指标相关性分析

9 Fib水平的影响因素

10特发性房颤患者血内皮功能和促凝指标的变化

11不同房颤类型血液炎症标记物及心脏超声指标的差异

12房颤患者双心房大小的相关关系

13房颤患者CRP水平与双心房大小的相关性分析

第四章讨论

第一节TNF-α启动子区SNP研究

第二节房颤与炎症

第三节房颤、炎症、内皮功能与促凝状态

第四节特发性房颤的内皮、凝血和血小板功能变化

第五节房颤心脏超声指标特点及意义

第五章结论

参考文献

Review：The relation of Atrial Fibrillation and Inflammation

成 果

致谢

统计学证明