几种药物代谢相关蛋白基因在结肠癌细胞中的表达与化疗敏感性的相关性

摘要

目的： 本研究首先通过检测5种不同结肠癌细胞株中TS、TP、GST-π、pgp、MRP1等药物代谢相关基因的mRNA和蛋白表达水平的差异，结合5-FU、L-OHP的体外药敏实验，探讨TS、TP、GST-π、pgp、MRP1表达水平与5-FU、L-OHP化疗敏感的相关性，从中分析耐药细胞株中药物代谢相关基因表达谱，为临床开展耐药指标筛查指导结肠癌个体化化疗提供依据。 同时，分别通过无血清培养基（Serumfreemedium，SFM）悬浮培养和免疫磁珠分选技术（Magnetic-activatedcellsorting，MACS）从普通SW480细胞中获取结肠癌干细胞（coloncancerstemcell，CSC），比较结肠癌干细胞及其亚群和普通SW480中耐药相关基因的表达水平差异，初步探索结肠癌干细胞的耐药机制。 材料和方法： 1、主要材料：人结肠癌活检标本，人结肠癌细胞株SW1116、sw480、Lovo、HT-29、HCT116，鼠抗人TS单克隆抗体、鼠抗人TP单克隆抗体、鼠抗GST-π单克隆抗体，鼠抗人Mdr-1单克隆抗体，鼠抗人MRP1单克隆抗体，总RNA提取试剂盒，引物，5-FU，L-OHP；DMEM/F12培养基，表皮生长因子（EGF），碱性成纤维生长因子（bFGF），B27添加剂，CD44+干细胞免疫磁珠分离试剂盒，CD166+干细胞免疫磁珠分离试剂盒。 2、方法： 2．1免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC） 通过内镜活检钳取结肠腺癌组织标本，常规福尔马林固定，石蜡包埋、病理切片，经过烤片、二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，根据不同抗体的要求进行相应抗原修复；PBS冲洗后滴加3%H2O2孵育10分钟阻断内源性过氧化物酶；再次PBS冲洗，滴加特异性小鼠抗人单克隆一抗，4℃孵育过夜；PBS冲洗后滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，室温孵育30分钟；PBS冲洗后DAB染色30秒，苏木素复染，1%盐酸酒精分化、自来水冲洗返蓝，最后进行脱水、透明、封片。 2．2细胞培养（cellculture） 结肠腺癌细胞株SW1116、sw480、Lovo、HT-29、HCT116由我科实验室常规保种，复苏后加入含10%胎牛血清RPMI1640培养液，接种至25c㎡培养瓶中，放入5%CO237℃恒温培养箱培养。 2．3免疫印迹分析（Westernblottinganalysis，WB） RIPA裂解液加入贴壁培养细胞冰上裂解培养细胞30min，每5分钟使用超声粉碎仪粉碎一次，4℃20000g离心30min后取上清获取总蛋白。采用BCA法测定总蛋白浓度，加入5XSDS蛋白上样缓冲液95℃变性5min。配胶后每孔上样50ug，SDS-PAGE凝胶电泳，根据目的蛋白分子大小不同使用2mA/c㎡转膜。5%脱脂奶粉37℃封闭1h，加入稀释好的小鼠抗人一抗TS（1：300），PD-ECGF（1：400），GST-P1（1：500），Pgp（1：200），MRP1（1：200）4℃孵育过夜。TBST洗膜5分钟×3次后加入山羊抗小鼠二抗（1：3000）37℃孵育1h。洗膜后加入ECL发光试剂盒发光，曝光、显影、定影后进行摄影，图象分析。 2．4免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC） 细胞贴壁生长于盖玻片，使用4%多聚甲醛进行固定，0．2%Triton/0．01MPBS透膜后采用Maxvision二步法免疫组化检测系统进行染色。 2．5WST-8分光光度法（WST-8colorimetricassay，CCK8）体外药敏实验 抗肿瘤药物氟尿嘧啶、奥沙利铂梯度稀释溶解于RPMI1640培养基，加入到96孔板贴壁培养4h的SW1116、SW480、LOVO、HT-29、HCT116细胞中孵育作用48小时，加入WST-8（2-（2-methoxy-4-nitrophenyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium，monosodiumsalt）溶液处理1小时，采用酶标仪检测不同药物浓度处理的细胞在450nm波长的光密度（OD450）。不同药物浓度处理细胞的OD450与对照处理细胞OD450比值即为化疗药物对肿瘤细胞的抑制率（inhibitionrate），根据不同浓度药物的抑制率作出抑制曲线，计算5-FU和L-OHP对5株结肠癌细胞株的半数抑制浓度（50%inhibitionconcentration，IC50）。 2．6无血清培养（serumfreemedium，SFM）结肠癌干细胞 将SW480重悬至含20ng/mlEGF，10ng/mlbFGF，10ng/mlLIF，B27（1：50）和2mmol/LL-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基（serum-freemedium，SFM），接种于超低贴壁培养瓶（ultralowattachmentflask），放入5%CO237℃恒温培养箱培养进行悬浮培养。待SW480形成典型干细胞球（Tumorspherecells）后，收集结肠癌干细胞。 2．7免疫磁珠分选（Magnetic-activatedcellsorting，MACS） 贴壁培养SW480加入0．25%胰酶消化，收集约108细胞重悬于含22．4g/L葡萄糖、0．5%BSA的0．01MPBS缓冲液中，按CD44、CD166干细胞分离试剂盒说明书依次加入人Ig、半抗原耦联的抗CD44、CD166单克隆抗体、抗半抗原结合的免疫磁珠进行孵育标记，然后将细胞缓慢通过固定于磁场的分离柱收集CD44或CD166阳性细胞，洗脱的即为CD44、CD166阴性细胞。结肠癌干细胞CD44+、CD166+亚群。 2．8RealtimePCR定量扩增 采用总RNA提取试剂盒（TRIZOLreagent）分别提取结肠癌细胞株、结肠癌干细胞以及结肠癌干细胞CD44+、CD166+亚群总RNA，进行逆转录反应（reversetranscription，RT）获取目的基因的cDNA，同时对不同细胞药物代谢相关基因进行定量PCR扩增，比较不同细胞株中药物代谢基因的表达差异。 2．9统计学处理 应用SPSS13．0软件，不同细胞株之间药物代谢相关基因mRNA表达水平、化疗药物IC50的不同采用单向方差分析（One-wayANOVA）进行比较。5-FU和L-OHP的IC50与药物代谢相关基因mRNA表达水平相关性分析采用spearman双变量相关分析。SW480和CSCs、CD44+SW480和CD44-SW480、CD166-SW480和CD166+SW480中药物代谢相关基因mRNA表达差异均采用独立样本t检验（IndependentsamplesT-test）比较。P<0．05具有显著统计意义。 结论： 1、结肠癌中药物代谢相关蛋白TS，TP，GST-π，Pgp，MRP1表达普遍，体外药敏实验证实结肠癌中TS、TP、Pgp的表达水平与5-FU的化疗敏感性呈负相关，而GST-π、Pgp、TP的表达水平则与L-OHP化疗敏感性呈负相关。因此，在结肠癌化疗前采用RealtimePCR或免疫组化检测肿瘤组织中药物代谢相关蛋白表达水平，对于临床医生选择相对敏感的化疗方案，对结肠癌患者进行个体化治疗具有重要的指导作用。 2、结肠癌干细胞及CD44+亚群中不同程度高表达MRP1、TP，提示结肠癌干细胞逃避化疗药物杀伤可能是结肠癌患者化疗失败，导致肿瘤进展的根本原因。进一步研究针对结肠癌干细胞的靶向杀伤药物，对于提高结肠癌治疗反应率，改善患者预后具有里程碑式的意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章 大肠癌细胞中药物代谢相关基因表达与化疗敏感性的相关性

引言

一、主要材料

二、实验方法

三、 结果

四、小结

第二章 药物代谢相关基因在结肠癌干细胞中表达初步研究

引言

一、主要材料

二、实验方法

三、结果

四、小结

全文讨论

全文小结

参考文献

附录 中英文缩略词对照表

攻读学位期间发表的论文

致谢

统计学证明