流感病毒H1N1亚型血凝素和神经氨酸酶的序列分析

摘要

流行性感冒(Influenza)简称流感,由流感病毒(Influenza virus)引起的急性呼吸道传染病,流感病毒大致分为A、B、C三种类型。流感每年都有不同规模的小流行,并且若干年一次全球范围的大流行,给人类的健康和经济的发展带来负面影响。
　　 流感病毒的包膜是包裹在基质蛋白之外的一层磷脂双分子层膜,这层膜来源于宿主的细胞膜,成熟的流感病毒从宿主细胞出芽,将宿主的细胞膜包裹在自己身上之后脱离细胞,去感染下一个目标。包膜中有两种非常重要的糖蛋白:血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)。
　　 血凝素因为能够与红细胞表面的糖蛋白受体结合,引起红细胞聚集而得名。HA单体是由3条以非共价形式连接的糖蛋白肽链构成三聚体。HA的表面有5个抗原决定簇,其抗体能够抑制血凝以及中和病毒,抑制病毒从感染细胞释放出来,是重要的保护性抗体。但是HA的氨基酸序列非常容易发生改变,从而导致HA抗原性的变异,因此,成为流感病毒亚型分类的主要依据。
　　 每个HA单体可分成两部分,一部分由HA1构成的球形头部,含有受体位点和抗原决定簇；另一部分为柄,由HA1一部分和整个HA2组成,插入囊膜。HA是流感病毒感染宿主细胞的先决条件,流感病毒通过其表面的HA1区与宿主细胞膜表面的受体唾液酸结合,HA2区与宿主细胞表面发生膜融合从而使流感病毒进入宿主细胞。故HA1区对防治病毒侵入宿主细胞有重要意义,因此,本研究以HA1基因为研究重点。
　　 神经氨酸酶可以水解宿主细胞表面的糖蛋白N-乙酰神经氨酸,释放成熟的流感病毒体,并防止新生病毒的聚集。NA具有抗原性,抗NA的抗体可以抑制新生流感病毒从宿主细胞中释放,但不具有中和病毒的作用。因此,HA和NA在流感病毒复制过程中的作用至关重要。
　　 本论文的研究内容主要由两个部分组成:
　　 第一部分:2000～2009年H1N1亚型流感病毒血凝素基因HA1的进化分析和序列解析。
　　 这一部分的目的是研究2000-2009年世界各地不同物种的H1N1流感病毒HA1基因的演变特征。首先,从NCBI数据库下载所需序列,采用生物信息软件对其构建种系发生树,分析病毒序列的进化关系。其次,对HA1氨基酸序列进行基因位点特性分析,包括受体结合位点、抗原决定簇以及潜在糖基化位点的分析,由此来推测该分离株的基因变异情况。
　　 进化树的结果显示:2009年新型流感病毒和2000-2008年人H1N1流感病毒差异较大,不在一个分支上,而与北美H1N1猪流感病毒位于一个小分支,并且有较近的亲缘关系。这说明了,新型流感病毒为变异病毒,并且很有可能由北美洲的H1N1猪流感病毒进化而来。除此之外,猪H1N1毒株部分存在于禽H1N1主干,部分存在于人H1N1主干。说明在进化过程中,猪H1N1与禽、人H1N1都有相似之处,而新型流感病毒又可能由猪流感病毒进化而来,所以导致09年的新型流感病毒跟往年流感病毒相比产生了很大的变异。
　　 HA1蛋白含有5个抗原决定簇,在它的三维构象中,A、B抗原决定簇都位于蛋白质的头部,尤其是B簇直接位于抗原结构的最顶部,更容易与抗体接触而发生位点变异,而这些变异的毒株更有可能成为新的流感病毒株。新型流感病毒之所以取代2000～2008年的人流感病毒,在2009年占主导地位,因为他们在抗原决定簇发生突变的位点有20个,涉及4个抗原决定簇。病毒株HA1基因抗原决定簇和多个受体结合位点发生变异,并且新型病毒与猪H1N1流感病毒在大多数变异位点的氨基酸相同。由此可以再次推论,新型流感病毒很大可能是从猪H1N1流感病毒进化而来。
　　 因此,本论文在第一部分的结论是:2009年新型流感病毒毒株HA1基因可能由早期来自北美洲的H1N1猪流感病毒进化而来,在进化过程中,一些重要位点的变异导致HA1基因发生抗原性变异,从而导致流感的大爆发。
　　 第二部分:2000～2009年H1N1亚型流感病毒神经氨酸酶的进化分析和序列解析。
　　 这一部分的目的是研究2000-2009年世界各地不同物种的H1N1流感病毒NA基因的演变特征。首先,本论文选取了2000～2009年世界各地的人/猪/禽H1N1亚型流感病毒毒株,从NCBI数据库下载所需序列,采用生物信息软件对其构建种系发生树,分析病毒序列的进化关系。其次,对NA氨基酸序列进行位点基因特性分析,主要包括抗原决定簇、酶活性位点以及潜在糖基化位点的分析,由此来推测该分离株的基因变异情况。
　　 NA氨基酸的进化树结果显示:2009年的新型流感病毒和以往的人流感病毒相隔较远,而与禽和猪源的流感病毒相隔较近。在2000～2008年人流感病毒组成的分支中,含有一株来源于2000年的禽流感病毒。并发现,他们的NA氨基酸序列具有极高的相似性,可以认为这些毒株之间具有同源性。说明很有可能,人流感病毒和禽流感病毒的NA基因片段发生了重组,从而导致了NA的抗原转移。
　　 NA蛋白含有7个抗原决定簇,本论文选取的病毒NA序列的抗原决定簇当中的大部分位点十分保守,个别发生变异的抗原位点均位于NA蛋白质的头部。并且发生变异的这些序列并不十分重要,对NA的抗原性改变没有特别重要的意义。NA蛋白的酶活性中心位于NA的头部,本论文当中构成酶活性中心的氨基酸残基基本上高度保守,只有少数个别酶活性发生变异,并且变异株很少,范围也不广。其中一个酶活性位点的变异发生在两株来自2008年的人源流感病毒株,由组氨酸H变为酪氨酸Y。还有的酶活性位点的变异发生在极少数人/禽/猪流感病毒中,并且变异范围不是很广,主要集中在北美和亚洲地区。有一些流感药物是专门针对NA酶活性中心设计的,尽管2000～2008间极少数流感病毒的酶活性中心位点发生变异,也许可以说明为什么2009年出现的新型流感病毒对传统抗流感药物产生耐药性。
　　 本研究结合了甲型H1N1流感病毒HA1和NA蛋白变异特征与规律、进化趋势等因素。运用生物信息学工具,对2000～2009年间H1N1亚型流感病毒的HA1和NA蛋白的关键位点特征和病毒进化情况。为以后我国流感病毒的流行检测与防治工作提供了基础理论依据。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 流感病毒概述

1.1 流感病毒(INFLUENZA VIRUS)简介

1.2 流感病毒表面抗原血凝素

1.3 流感病毒表面抗原神经氨酸酶

1.4 系统进化树

第二章 H1N1甲型流感病毒血凝素基因HA1的序列解析和进化分析

2.1 材料与方法

2.1.1 资料来源

2.1.2 血凝素基因HA1种系发生树的构建

2.1.3 血凝素基因HA1的同源性分析

2.1.4 血凝素基因HA1的序列分析

2.2 结果

2.2.1 2000~2009年血凝素基因HA1的进化分析

2.2.2 同源性分析

2.2.3 HA1基因推导的氨基酸位点变异

2.3 讨论

2.3.1 系统发生树的选择

2.3.2 系统发生树的分析

2.3.3 HA1基因推导的氨基酸位点分析

第三章 H1N1甲型流感病毒神经氨酸酶的进化分析和序列解析

3.1 材料与方法

3.1.1 资料来源

3.1.2 种系发生树的构建

3.1.3 同源性分析

3.1.4 序列分析

3.2 结果

3.2.1 2000~2009年H1N1甲型流感病毒NA的进化分析

3.2.2 2000~2009年H1N1甲型流感病毒NA的同源性分析

3.2.3 NA基因推导的氨基酸位点变异

3.3 讨论

结论

参考文献

攻读硕士期间发表论文

致谢

统计学审稿证明