生物工程材料介导的成体干细胞移植治疗大鼠脑损伤修复的实验研究

摘要

外伤性脑损伤是全球性的多发性伤病,也是死亡率和致残率最高的伤病之一,并且会造成严重的家庭和社会经济负担。促进颅脑损伤后神经修复与再生是当前研究的热点和难点。
　　 脑的自我修复能力有限,存在于脑组织中的内源性干/祖细胞对损伤的应答,产生新的有功能的细胞能力有限,而且受损的中枢内微环境也不适合神经组织的再生,因此治疗脑损伤的策略在于改善损伤局部的微环境,使其适于神经组织的修复,同时移植入外源性细胞替代失去功能或死亡的细胞,并与宿主细胞形成具有功能的整合,改善神经行为缺陷。
　　 受损伤脑组织的功能重建与局部血管网的重建、改善新陈代谢环境也关系密切。目前认为,成体新血管的形成过程是血管生成和血管发生两个过程的复合,血管生成是毛细血管从膨大的小血管侧长出的过程；而血管发生是通过血管内皮祖细胞(endothelia progenitor cell,EPCs)原位形成血管。当脑组织受损缺失时,组织空洞中移植入的神经干细胞在没有血管形成的情况下,仅依赖损伤周边区域的血管生成,无法得到生存所需的充足养分,如果有EPCs作为血管发生的原基而原位形成血管、则会大大有利于受损伤脑组织的结构与功能修复。当前的大部分脑损伤干细胞移植研究都缺乏对此问题的考虑,也由此导致移植入的细胞生存率很低。本实验拟通过移植入EPCs,结合生物工程材料的方式,促进脑损伤的组织空洞中血管网的重建。移植入的EPCs将充当新血管形成的底物,并且运用旁分泌的方式促进血管生成。
　　 神经干细胞(neural stem cells,NSCs)具有自我增殖和分化能力,能够分化为神经元和星形胶质细胞及少突胶质细胞等,可以用于中枢神经系统损伤后移植替代失去功能或死亡的细胞,移植入的细胞分化的神经元能与宿主细胞形成具有功能的整合,改善和恢复缺失的神经功能,移植入的细胞分化的星形胶质细胞可以通过产生神经营养物质改善损伤局部的微环境,并且为移植入的神经元和损伤局部迁移再生的神经元提供物理支撑,使其适于神经组织的修复,而移植入的细胞分化的少突胶质细胞可能参与损伤局部的免疫反应。
　　 目前生物工程材料已经广泛使用在皮肤、骨骼、软骨、血管、外周神经及脊髓等组织缺损的再造和修复。组织工程策略目的在于提供种子细胞粘附的支架。本课题拟采用的生物工程水凝胶材料为移植物的基质材料,其优势在于可注射性,便于移植操作,自动塑性,适应性强,适用范围广。
　　 本实验拟在采用控制性脑皮质撞击(controlled cortical impact,CCI)制作标准化的中度脑损伤模型的基础上,应用成体来源NSCs、EPCs联合生物工程水凝胶材料进行脑损伤空腔内移植,以期能够替代损伤缺失的脑组织细胞,并且建立新的功能联系,恢复受损的神经功能。
　　 目的:获取并体外扩增成年大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)、脂肪来源干细胞(adipose tissue derived stem cells,ADSCs),并分别向神经干细胞(neural stem cells,NSCs)及血管内皮祖细胞(endothclial progenitorcells,EPCs)方向诱导分化,分别检测其表型及功能,对比不同来源细胞的差异。
　　 方法:取大鼠股骨、胫骨骨髓,密度梯度法分离获取BMSCs。取大鼠腰部白色脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化法获取血管基质片,运用“DMEM/F12+10％胎牛血清(FBS)”扩增ADSCs。运用碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和N2等诱导成NSCs,运用“低糖DMEM培养液+10-8mol/L地塞米松+5％FBS+20ng/mL,血管内皮生长因子(VEGF)+5ng/mL bFGF+5ng/mL胰岛素样生长因子(IGF)”配方的分化培养液诱导成EPCs。免疫荧光细胞化学和流式细胞术鉴定间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、NSCs、EPCs的表面特征抗原。细胞计数检测细胞增殖能力。通过乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)摄取和墨汁吞噬试验、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA表达检测、体外血管生成实验等细胞功能方面检测进一步确认诱导出的EPCs是否具有生理功能。
　　 结果:体外可成功扩增大鼠成体来源BMSCs和ADSCs,细胞呈长梭形,以ADSCs胞体更长,细胞排列更具方向性。BMSCs和ADSCs均能成功诱导出Nestin阳性的NSCs,并且在适当培养条件可以进一步诱导分化为GFAP、Neun阳性细胞。通过本实验设计诱导方案可成功将BMSCs和ADSCs诱导为EPCs,细胞表型CD34-、CD133+、血管假性血友病因子(vWF)+和Flk-1+,并且两种来源的EPCs增殖能力无差异。两种细胞来源的EPCs均能摄取Ac-LDL而不吞噬墨汁,eNOS的表达也与成熟的内皮细胞无差异,并且具有体外血管生成能力。
　　 结论:MSCs能够分离自大鼠成体骨髓和脂肪组织。它们均具有较强增殖能力并且能够被诱导分化为NSCs和EPCs。诱导得到的EPCs是具有生理功能的细胞。
　　 目的:体外检测培养细胞与生物工程水凝胶材料的相互影响,为体外培养细胞与生物工程水凝胶共移植治疗提供理论依据。
　　 方法:选择两款不同组分的水凝胶Matrigel和PuraMatrix作为实验材料,以前述方法获得的EPCs作为检测细胞,将EPCs培养于不同浓度的Matrigel(10％、20％、30％)或PuraMatrix(0.25％、0.5％、1％)表面,或与不同浓度的Matrigel或PuraMatrix混悬培养,于培养的不同时间观察培养细胞的形态,并用Alamar Blue法检测细胞的增殖情况,以确定材料的细胞毒性。观察EPCs在水凝胶中的成管化状态,以检测细胞是否仍具有生理功能。将前述方法获得的NSCs与最佳浓度的水凝胶共培养观察细胞的生长情况,用免疫细胞化学法检测其分化情况。
　　 结果:三种浓度Matrigel中30％的Matrigel细胞毒性较大,而三种浓度的PuraMatrix中1％的PuraMatrix细胞毒性较大。EPCs培养于Matrigel表面较混悬其中的细胞增殖率高,而且此差异随Matrigel的浓度增高而增强。EPCs在20％和30％的Matrigel表面培养均能成管化,在10％的Matrigel表面和混悬其中培养7天,多数细胞沉底。20％的Matrigel中培养7天能够立体成管化。而30％的Matrigel中,EPCs仅能伸出少数突起,不能成管化。PuraMatrix在0.25％和0.5％的浓度时,EPCs培养于PuraMatrix表面与细胞混悬其中的细胞增殖率相比无明显差异；而在1％时EPCs培养于PuraMatrix表面和混悬其中存活率均很低。EPCs在0.25％和0.5％的PuraMatrix表面培养,细胞能够穿入PuraMatrix中。而在0.25％的PuraMatrix中培养细胞可附着于材料上,但较难成管化,0.5％的PuraMatrix中培养7天能够成管化。三种细胞密度相比,107个/mL的细胞密度EPCs更容易体外成管化。NSCs在水凝胶中能够迁移分化,并且0.5％PuraMatrix较20％Matrigel中细胞向神经元样细胞分化比例较高。
　　 结论:Matrigel和PuraMatrix在适当的浓度(20％Matrigel和0.5％PuraMatrix)均能与培养细胞良好的相容,并且起到支撑作用,模拟正常生理状态,给细胞提供一个三维生长环境,并且能够促进NSCs细胞分化。由于PuraMatrix为人工合成肽产物,降解产物无毒性,可能是更适合移植的生物材料。
　　 目的:观察体外扩增的干、祖细胞及生物工程水凝胶材料共同移植对脑损伤后的神经功能恢复的影响。
　　 方法:健康成年Wistar近交系大鼠随机分为正常对照组、假手术组、生理盐水移植组、单纯水凝胶移植组、EPCs联合水凝胶移植组、NSCs联合水凝胶移植组、NSCs和EPCs联合水凝胶移植组。采用改良自由落体撞击脑损伤模型,损伤7天时于原损伤区行移植术,分别于动物造模成功后6天、移植术后1、2、3、4周进行肢体运用不对称试验、运动评价,移植术后30天行水迷宫实验。移植35天处死实验动物,完整取脑常规石蜡固定,包含损伤灶的脑组织行连续冠状位切片。HE染色后计算损伤所致空腔体积,分析各组损伤恢复情况。FITC-dextran灌注观察损伤局部血管分布情况。免疫组织荧光化学法染色,分析移植细胞的存活和迁移情况,以及损伤灶局部组织修复的病理改变。
　　 结论:体外扩增NSCs、EPCs及生物工程水凝胶材料共移植有促进局灶性脑外伤大鼠神经功能恢复的作用,其中生物工程水凝胶材料能够为移植细胞提供物理支持和攀附支架,EPCs能够参与损伤局部的血管重建,改善损伤局部的微环境,有利于损伤修复,NSCs能够分化为神经元补充脑损伤的神经缺失,细胞结合生物工程材料的移植体是脑损伤修复的较佳。

目录

文摘

英文文摘

研究背景

参考文献

第一章 不同来源成体基质细胞的增殖能力、诱导分化潜能的体外实验研究

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第二章 体外培养细胞与生物工程水凝胶材料相容性的实验研究

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第三章 体外扩增干、祖细胞及生物工程水凝胶材料共移植对局灶性脑外伤大鼠神经功能恢复的影响

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

全文总结

附录1 (缩写词中英文对照表)

附录2 (主要仪器设备)

附录3 (主要试剂)

综述

参考文献

成果

致谢

统计学审稿证明