基于核酸适配体的细菌内毒素液相和固-液相检测方法研究

摘要

感染性疾病是世界十大致命性疾病之一,尤其是在发展中国家,儿童和外伤患者因感染性疾病导致的死亡率较高。在感染性疾病中,以革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria,GNB)感染败血症、内毒素血症及其休克的临床死亡率最高。GNB感染时,细菌和/或脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)即内毒素(Endotoxin)进入血循环,激活多种炎症细胞释放炎性介质,引起炎症反应,严重时可导致多器官功能衰竭。
　　 LPS是GNB外膜的主要成分,由类脂A、核心寡聚糖和O-特异性多糖侧链三部分组成。LPS对于维持GNB的外膜渗透性和流动性及其致病过程起主要作用。LPS还可直接或间接诱导免疫细胞凋亡,抑制机体免疫功能,从而加重败血症的发生,因此LPS的检测具有重要的医学意义。目前临床上内毒素的检测方法,主要有鲎变形细胞溶解物(LAL)试验、动态浊度法、与重组因子C相关的检测方法等,但主要还是以鲎变形细胞溶解物试验最为常用,该方法灵敏度和特异性较高,但对LPS的污染极为敏感,对所用器皿的消毒要求高,且活性易受某些金属离子、抗生素、氨基酸、糖类、血浆蛋白等影响,检测品种有限。
　　 近年的研究表明,DNA和RNA不仅仅起遗传信息储存和传递的作用,而且可以通过自身特有的结构与其它类型分子相互作用,以此为基础可以建立人工设计的随机寡核苷酸库,从这类随机序列库中筛选出与靶分子高度特异结合片段的过程,称为指数富集系统进化配体(systematic evolution of ligands byexponential enrichment,SELEX),筛选出的分子被称为“核酸适配体”(适体,aptamer),其作用形式与抗体相似,可与靶分子高亲和力、特异性的结合,其解离常数可达到pg级。
　　 本课题拟采用核酸适配体技术研究出一种灵敏度高、特异性高、稳定性强、且不易受外界因素影响的新型细菌内毒素检测方法,同时也可为相关的内毒素检测试剂盒或生物传感器的研发提供基础,既能满足对细菌内毒素检测快速准确的要求,又能降低检测成本,扩大应用范围,为临床诊断、环境监测、食品安全等与人们日常生活息息相关的领域中的内毒素检测开创新的途径。
　　 方法:1缓冲溶液的选择。选取新鲜灭菌注射用水(WFI,pH=5.61,内毒素含量<0.03 EU/ml)、磷酸盐缓冲液(PBS,0.1mol/L,pH=7.3,用灭菌纯净水配制)和三羟甲基氨基甲烷(Tris,0.02mol/L,pH=7.4)参与培育内毒素与核酸适配体的介质环境选择性实验。2 培育时间的优化。选择PBS作为培育介质进行最佳培育时间的选择试验,根据相关参考文献和多次的预试验结果,具体的时间分组为30 min、1 h、2 h、2 h、4 h。3 核酸适配体最佳摩尔量的优化。分别选取5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 剂量组的核酸适配体进行最佳摩尔量的优化实验。4 内毒素核酸适配体检测的选择性比较。核酸适配体的选择性是衡量该方法优劣的重要因素之一。随机选取一段核酸适配体,即Aptamer Ⅲ分别取代Aptamer Ⅰ和Aptamer Ⅱ与LPS反应,以确定LPS与其他Aptamer是否有非特异性结合。5 基于核酸适配体用于内毒素的固-液相检测。综合以上各种检测条件的优化结果,并将内毒素分为0.0312 EU/ml、0.0625 EU/ml组、0.125 EU/ml组、0.25 EU/ml组、0.5 EU/ml组、1 EU/ml组、2 EU/ml组、4 EU/ml组,进行内毒素核酸适配体的固-液相检测。6 基于核酸适配体用于内毒素的检测(液相检测)。将羟基活化的磁性纳米颗粒与一条5ˊ端带氨基修饰的适体(Aptamer,核酸适配体)反应结合,利用适体与LPS的强结合作用捕获LPS分子,并通过磁性分离技术去除杂质蛋白干扰。另一条带荧光标记的适体结合LPS的另一位点,用以测定LPS的量。7 凝胶法检测磁珠分离液。将吸附在磁珠上的细菌内毒素和核酸适配体结合物用特定的方法洗脱下来,并用鲎试剂对洗脱液进行检测,以证实内毒素液相检测的有效性。8 固-液相和液相检测反应液稳定性检测。将固-液相和液相检测反应液分别置于37℃恒温箱内放置6 h、12 h、24 h,再用荧光分光光度计测其荧光值。9统计学分析。均采用SPSS13.0版本进行统计学分析,基于核酸适配体的内毒素液相和固相-液相检测用双变量相关分析(Pearson's)进行分析；单变量方差分析和析因设计的方差分析用于缓冲溶液的选择、培育时间的优化、核酸适配体剂量的优化、内毒素核酸适配体检测的选择性比较实验,所得数据以均数±标准差((x)±s)表示,另外,用两两比较LSD分析方法进行各实验组之间的统计学验证。
　　 结果:1 缓冲溶液的选择。内毒素在新鲜灭菌注射用水(WFI)、磷酸盐缓冲液(PBS)和Tris缓冲液与核酸适配体共同孵育,都可产生相互的亲和作用(F=2227.874,P=0.000)。内毒素在三种缓冲液中的荧光信号差异无统计学意义(F=0.119,P=0.889)。磷酸盐缓冲液和三羟甲基氨基甲烷缓冲液中所含的Mg2+、ca2+、Na+和K+等离子的浓度对内毒素与其核酸适配体的结合没有影响。选择这三种缓冲液中的其中一种作为内毒素与核酸适配体孵育的介质环境均可行。2培育时间的优化。在孵育初期,随着时间的逐渐增加,荧光强度慢慢增强,内毒素结合核酸适配体的量逐渐增加,孵育2 h后荧光强度趋于稳定,在该浓度下,荧光强度基本达到饱和状态,此时内毒素与核酸适配的结合作用基本完成,在各时间段里内毒素均可与核酸适配体产生结合作用(F=922.448,P=0.000)。另外,对于2 h和4 h所测得的结果,两者差异无统计学意义(P=0.850),在此选择2 h作为核酸适配体与内毒素的培育时间。3 核酸适配体最佳摩尔量的的优化。内毒素与不同浓度的核酸适配体Ⅰ结合后再与固定浓度的核酸适配体Ⅱ反应,各个浓度剂量组均与内毒素产生结合反应(F=17323.631,P=0.000)。从最小浓度的5μmol/L,开始荧光强度逐渐增强,尤其是5μmol/L到10 μmol/L之间的坡度最明显,析因设计资料的两两比较统计学分析表明,两剂量组之间的差异具有统计学意义(P<0.001),10 μmol/L到80μmol/L的荧光数值渐趋稳定,
　　 经多重比较统计学分析,不同浓度之间的差异没有统计学意义(P>0.5),在此选择10 μmol/L的核酸适配体Ⅰ作为孵育浓度。内毒素和固定浓度的核酸适配体Ⅰ结合后与不同浓度的核酸适配体Ⅱ孵育过程中,各个剂量组均与内毒素产生结合反应(F=22658.582,P=0.000)。从最小浓度的5 μmol/L开始荧光强度逐渐增强,尤其是5 μmol/L到10μmol/L之间的坡度最明显,析因设计资料的两两比较统计学分析表明,两剂量组之间的差异具有统计学意义(P<0.001),10μmol/L到80μmol/L的荧光数值渐趋稳定,经统计学分析,它们之间的差异没有统计学意义(P>0.5),因此,选择10μmol/L的核酸适配体Ⅱ作为孵育浓度。4 内毒素核酸适配体检测的选择性比较。当以任意DNA系列代替检测中的一条核酸适配体时,都不能形成三明治结构,在溶液中检测不到明显的荧光,经过各序列组间析因设计资料的方差分析两两比较统计学比较验证,B和C曲线之间差异无统计学意义(P=0.909)。仅当溶液中存在与内毒素两个作用位点特异性结合的两条核酸适配体时才能形成三明治结构,A和B、c曲线之间差异有显著性意义(P=0.000)。5 基于核酸适配体用于内毒素的固-液相检测。荧光强度随内毒素剂量升高而升高,两者呈线性关系,经双变量相关分析发现内毒素和荧光强度两者呈显著相关关系(Pearson's:r=0.897,P=0.003)。经过检测条件的优化后,可以看到溶液中的荧光强度随着内毒素的剂量升高而升高,提示着运用核酸适配体与靶标内毒素的强亲和力来检测内毒素取得了较好的效果。6基于核酸适配体用于内毒素的检测(液相检测)。荧光强度随着内毒素剂量的升高而升高,两者呈线性关系,荧光强度呈明显的LPS浓度依赖性增高,经双变量相关分析发现内毒素和荧光强度两者呈显著相关关系(Pearson’s:r=0.867,P=0.005)。7 凝胶法检测磁珠分离液。除了0.0312 EU/ml组因剂量较小的缘故未见明显阳性反应之外,其余各组均出现不同程度的凝胶现象。由此判断,把结合到磁珠上的物质用特定的方法洗脱下来,并通过凝胶法证实磁珠分离液中含有内毒素成份,也可间接反证上述的磁珠/核酸适配体/内毒素结合实验是有效的。8 固-液相和液相检测反应液稳定性检测。在各时间段,即6 h组、12h组、24 h组荧光信号均未见明显衰减,固-液相和液相两种检测方法检测细菌内毒素具有很强的稳定性,检测结果不随时间的增长而产生明显变化。
　　 结论:
　　 1 采用2个不同适体与内毒素形成高亲和力的三明治结构用于检测内毒素方法可行,其检测线性范围宽,特异性强,灵敏度高,检测信号稳定,重现性好,且不以内毒素为靶标的无关适体对其没有干扰。
　　 2 液相检测法中采用磁珠分离技术可大大消除非特异性吸附,进一步提高检测效率,敏感度比固-液相检测法要高。
　　 3 基于核酸适配体用于内毒素的固-液相检测和液相检测的检测结果具有很强的稳定性,在24h之后荧光信号并无衰减。

目录

文摘

英文文摘

第一章 核酸适配体的选择与优化

1.1 SELEX技术原理

1.2 SELEX技术主要步骤

1.3 SELEX的特点

1.4 本课题主要研究目标

1.5 材料与方法

1.6 实验方法

1.7 结果

1.8 讨论

第二章 固-液相方法检测细菌内毒素

2.1 材料与方法

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 基于核酸适配体的液相方法检测细菌内毒素

3.1 实验材料与方法

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

结论

参考文献

中英文缩略对照表

研究生期间发表的文章

附录

参考文献

致谢

统计学证明