鼻咽癌超微结构及Ki-67、p53表达的定量分析与诊断预后的关系

摘要

鼻咽癌(nasophatyngeal carcinoma,NPC)是我国华南地区常见恶性肿瘤之一。广东、广西、湖南、福建等南方各地发病率较高,占鼻咽部恶性肿瘤的92％(1)。NPC的病理类型:(1).非角化性癌(未分化型,分化型,混合型)；(2)角化性鳞状细胞癌。NPC早期诊断较难。体视学理论与图像分析技术面向医学临床应用是目前国内外从事生物医学图像分析专家及病理学医生积极探索解决、希望能有所突破的问题之一。本实验通过对NPC细胞株、NPC组织、鼻咽部正常粘膜上皮、鼻咽部慢性炎症粘膜上皮的超微结构研究,力求揭示NPC细胞体视学超微结构特点、对NPC细胞进行量化诊断。
　　 Ki-67是发生在增殖细胞中表达的一种核抗原,Ki67的表达局限于细胞周期的G1期到M期,参与细胞有丝分裂,其阳性表达高低与细胞增殖活性密切相关。广泛应用于评估肿瘤细胞的增值活性,因此可作为评价细胞增殖状态、评估肿瘤的预后和判断恶性肿瘤远隔脏器转移危险性的重要指标。关于Ki67的表达与肿瘤预后的关系研究较多,多数研究提示Ki67的表达与肿瘤分化程度呈正相关,而与肿瘤的临床分期、是否伴随淋巴结转移、瘤体大小的关系在不同类型肿瘤中的研究结果不尽相同。多数学者认为Ki-67表达的高低与肿瘤的组织类型、分化程度及预后有关。目前国内有关Ki-67与NPC的文献报道较少。
　　 P53基因是一种广谱的抑癌基因,p53基因通过其产物p53蛋白实现对细胞周期的调控。P53蛋白只在人鼻咽癌组织中和癌旁不典型增生的上皮有表达,而在鼻咽正常组织中无表达。提示p53蛋白的过表达可能与人鼻咽癌的发生有密切的关系,p53蛋白阳性可作为鼻咽癌诊断的参考指标。国内外有关p53蛋白在结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌中表达的研究较多,p53蛋白在各种肿瘤的表达情况有所差别。以上文献报道均采用半定量的方法。
　　 目的和意义
　　 1.探讨NPC细胞的超微结构特征,为临床诊断NPC提供临床病理学诊断依据。
　　 2.定量分析Ki-67、p53蛋白在iNPC组织中的表达,从量化角度揭示其在NPC组织中表达的病理学意义。
　　 3.观察Ki-67、p53蛋白在NPC中的表达,从定量和半定量两方面探讨Ki-67、p53蛋白与NPC预后的关系,为临床分析NPC预后提供一定的病理学依据。
　　 材料和方法
　　 一.鼻咽癌超微结构分析
　　 实验材料:病例来自我校南方医院和珠江医院门诊及三九脑科医院门诊,所选标本是耳鼻喉科门诊鼻咽癌诊室医生钳取(鼻咽镜下)的新鲜鼻咽癌组织,共取疑似鼻咽癌最后病理论断为慢性炎症患者的炎性上皮12例,20例鼻咽癌患者的正常鼻咽上皮、鼻咽癌组织,共计52例标本。癌组织经病理确诊为非角化性鼻咽癌14例和角化性鳞状细胞癌6例(包括高分化鳞癌、低分化鳞癌)。纳入病例要求被取活检的鼻咽癌患者均未经任何抗肿瘤治疗(放、化疗),且为临床首次被确诊的鼻咽癌患者。鼻咽癌细胞株(5-8F和CNE-1)为南方医科大学肿瘤研究所保存细胞系。
　　 实验方法:新鲜标本采集后,离体后一分钟内切成大小为1～2mm3组织块三到五块,取材的刀片要锋利,低温操作,通常为4℃,1min内入2.5％戊二醛电镜固定液前固定,4℃固定2～4h,漂洗；后固定1.5～2h,漂洗；脱水；置换；浸透；包埋；在解剖显微镜下修块；半薄切片；HE染色；在解剖显微镜下和普通显微镜下定位；超薄切片；电子染色；干燥后电镜观察。摄片后测试细胞核的周长(Cn)、面积(An)、体积(v11)、体积密度(Vvn)、数密度(Nvn)、表面积密度(Svn),细胞的周长(Cc)、面积(Ac)共8个结构参数
　　 统计学分析:采用SPSS 13.0软件,对正常鼻咽上皮、鼻咽部慢性炎症上皮、鼻咽癌组织以及鼻咽癌细胞株(5-8F和CNE-1)的细胞和细胞核所测得的结构参数值进行单因素方差分析、组间的两两比较分析(L SD法)以及两组间采用独立样本t检验。
　　 二.Ki-67和p53在鼻咽癌中的定量表达及其与诊断预后的关系
　　 实验材料和分组:收集南方医科大学附属南方医院病理科2000年1月至2005年12月经常规HE切片后确诊为鼻咽癌(NPC)的活检标本79例,平均年龄47.00±11.72(14～70岁)；其中男性63例,平均年龄47.24±12.23(14～70岁)；女性18例,平均年龄46.12±9.89(27～67岁)；有淋巴结转移的37例,无淋巴结转移的42例:有远处转移的24例,无远处转移的55例；TNM分期Ⅰ期～Ⅱ期20例,Ⅲ期34例,Ⅳ期25例。以上病例均有较完整的临床资料和5年以上的随访结果,并且均为首诊、未经任何治疗的鼻咽癌患者标本。患者纳入标准:1.纳入标准:本院附属医院病理科2000-2005经病理活检确诊为鳞状细胞癌；2.首次就诊；3.治疗前活检标本完好；4.随访5年以上；5.病历资料完整。
　　 实验方法:采用免疫组织化学技术检测Ki-67和p53蛋白在鼻咽癌中的表达情况,用Leica Q500 MC图像分析系统测试Ki-67和p53蛋白的阳性单位(PU)值,定量分析Ki-67和p53在鼻咽癌中的表达及基于量化改变的变化规律,分析其与临床特征和生存时间的关系。
　　 统计学分析:应用SPSS13.0统计分析软件进行处理。各组实验数据以平均值±标准差(x±s)表示。采用独立样本t检验和单因素方差分析对数据进行统计分析,组间多重比较采用LSD法。以P<0.05表示差异具有显著性。应用Spearman法分析Ki-67、p53阳性细胞率与鼻咽癌患者生存时间之间的关系。采用Kaplan-Meier法进行生存分析,显著性检验采用Log rank法,对预后因素采用COX回归分析。
　　 结论
　　 1.鼻咽癌细胞与鼻咽正常上皮、炎性病变上皮细胞的定量测试结果表明,鼻咽癌细胞及核的结构发生明显的改变,其病理发展过程存在一个由正常鼻咽上皮→异型增生→癌变的渐进过程；因此在鼻咽癌的诊断分析中,可以用鼻咽癌细胞及核的结构参数值对鼻咽正常上皮细胞、异型增生上皮细胞及癌细胞进行判别分析。
　　 2.Ki-67蛋白表达程度与NPC远处转移、患者生存时间及TNM分期相关；Ki67阳性细胞率与患者生存时间相关。临床分期高、伴有远处转移、生存期短的患者其Ki-67蛋白PU值大,Ki-67蛋白表达强.Ki-67细胞阳性率越高,NPC患者生存时间越短；Cox回归模型(Cox regression)多因素生存分析显示:Ki67阳性细胞率是影响鼻咽癌患者预后的独立影响因素(BE=5.67、P=0.034)。结果表明,Ki67阳性细胞率每增加十个百分点,鼻咽癌患者的死亡率就增加5.67倍。
　　 3.p53蛋白表达程度与NPC远处转移及TNM分期相关。临床分期高、伴有远处转移的P53蛋白PU值大,P53蛋白表达强.鼻咽癌的临床分期、远处转移与P53蛋白表达也具有相关性,临床分期高、伴有远处转移的P53蛋白PU值大,P53蛋白表达强。

目录

文摘

英文文摘

前言

技术路线1

技术路线2

第一部分 鼻咽癌超微结构体视学分析

1 材料与方法

2 方法

3 结果

4 讨论

5.小结

参考文献

第二部分 Ki-67和p53在鼻咽癌中的定量表达及其与诊断预后的关系研究

1 材料与分组

2 方法

3 结果

4 讨论

五、小结

参考文献

全文小结

英文缩写注解

研究生期间发表论文

致谢

统计学审稿证明