四磺酸基酞菁锌与牛血清白蛋白配合物介导的光动力疗法治疗人脑胶质瘤

摘要

研究背景
　　 本课题的目的是研究新型第三代光敏剂--四磺酸基酞菁锌(ZnPcS4)与牛血清白蛋白(BSA)的配合物(ZnPcS4-BSA)对U251人脑胶质瘤的体外和体内光动力效应,为其在临床应用提供前期基础研究。
　　 胶质瘤是神经外科最常见的恶性肿瘤,其发病率、死亡率都非常高,预后很差。目前其治疗主要以手术+化疗+放疗为主,但疗效均不理想。寻找更有效的胶质瘤治疗方法,一直是世界各国医疗工作者和科研人员努力的方向。光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)是一种新型的医疗技术,对它的临床研究始于20世纪70年代,目前有很多种良恶性疾病的治疗都运用到了PDT这一手段,疗效也让人相当满意。这种方法也被应用到脑胶质瘤的治疗当中,但疗效有待进一步观察和大样本、长期随访研究。在胶质瘤的光动力治疗中,光敏剂起着一个举足轻重的作用,不同的光敏剂治疗效果和不良反应有很大的差异。第一代的光敏剂的组成不定,都是比较复杂的卟啉混合物,结构尚未完全确定；其最长激发波长在630nm,作用光谱不理想,因为此波长的组织穿透能力较差,其作用深度少于0.5 cm,对治疗大而深的肿瘤不理想；给药至光照时间隔长；在体内的滞留时间长,避光时间需4周以上,皮肤光敏副作用大。第二代光敏剂较第一代的有很大改善,但仍存在光敏剂在肿瘤组织中的选择性和富集能力有限的缺点。本研究采用的是第三代光敏剂ZnPcS4-BSA,其激发波长更接近红光,作用时间短,代谢更快,靶向性更强。该光敏剂对胶质瘤的光动力治疗效果如何,目前还没有人研究。基于此,本研究使用ZnPcS4-BSA对U251人脑胶质瘤作了体外和体内的研究,并对其作用机制进行了探讨。
　　 本研究分为两个部分,第一部分主要研究ZnPcS4-BSA对U251人神经胶质瘤细胞的体外光动力杀伤效应,探索该光敏剂的最佳用药浓度、最佳用药时间和最佳激光剂量,并对其杀伤机制进行探讨；第二部分主要是根据第一部分的实验结果,进一步研究ZnPcS4-BSA对荷瘤裸鼠的体内光动力杀伤效应,并对其杀伤机制进行分析。
　　 第一部分:新型光敏剂ZnPcS4-BSA对U251人神经胶质瘤细胞体外光动力杀伤效应及其机制研究
　　 目的:通过探讨四磺酸基酞菁锌(ZnPcS4)与牛血清白蛋白(BSA)的配合物(znPcS4-BSA)介导的光动力疗法(PDT)对体外培养的U251人神经胶质瘤细胞的光敏化作用,探索该光敏剂的最佳用药浓度、最佳用药时间和最佳激光剂量,并对其杀伤机制进行探讨,为进一步研究(ZnPcS4-BSA)应用于动物体内,及将来运用于临床胶质瘤的治疗提供实验数据与理论基础。
　　 方法:
　　 1.常规方法复苏、传代培养U251人脑胶质瘤细胞
　　 2.ZnPcS4-BSA的摄取规律
　　 紫外可见光分光光度计扫描ZnPcS4-BSA吸收峰值,并根据该峰值做浓度标准曲线；检测U251细胞内ZnPcS4-BSA的含量。得出ZnPcS4-BSA作用于U251细胞的最佳孵育时间。
　　 3.ZnPcS4-BSA本身对U251人脑胶质瘤细胞的细胞毒性作用
　　 分组:
　　 阴性对照组:不加ZnPcS4-BSA,只加生理盐水,
　　 8组不同浓度光敏剂组:浓度分别为0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/L
　　 处理:均不光照。CCK-8法测定细胞存活率。
　　 4.单用激光辐射对细胞的毒性
　　 5组U251细胞用剂量分别为25、50、100、200、400 J/cm2的激光照射,各组均不加光敏剂,CCK-8法测定细胞存活率。
　　 5.激光剂量对ZnPcS4-BSA介导PDT对细胞杀伤力的影响
　　 5组U251细胞均加入浓度为30μmol/L的ZnPcS4-BSA,孵育4h后,用剂量分别为25、50、100、150、200J/cm2的激光照射。CCK-8法测定细胞存活率。得出ZnPcS4-BSA介导PDT的最佳激光能量。
　　 6.ZnPcS4-BSA浓度对其介导PDT的影响
　　 分组:
　　 阴性对照组:不加ZnPcS4-BSA,无激光辐射培养的U251。
　　 5组不同浓度光敏剂组:浓度为20、40、60、80、100μmol/L,继续培养4h后,给予激光剂量为150 J/cm2辐射。
　　 处理:使用CCK-8法检测各组细胞存活率,并计算抑制率。得出ZnPcS4-BSA介导PDT的最佳ZnPcS4-BSA浓度。
　　 7.流式细胞术检测细胞凋亡
　　 取20μmol/L的ZnPcS4-BSA,100 J/cm2辐射组细胞进行凋亡检测实验,以同样条件培养而未作PDT治疗细胞作为对照。流式细胞仪上机检测,WinMD129软件分析凋亡。
　　 8.Real-Time PCR检测VEGF基因表达
　　 取20μmol/L的ZnPcS4-BSA,100 J/cm2辐射组细胞进行VEGF基因检测,以同样条件培养而未作PDT治疗细胞作为对照。用荧光定量PCR仪、cDNA合成试剂盒与All-in-OneTM qPCR Mix检测VEGF基因表达。
　　 9.数据资料采用SPSS17.0软件包进行统计分析。结果以均数±标准差表示,以P≤0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.U251人脑胶质瘤细胞经复苏多次传代生长良好,具有恶性胶质瘤的病理形态特征；
　　 2.紫外扫描发现ZnPcS4-BSA于684nm处有吸收波峰,并制作标准曲线,相关系数r=0.999,P<0.001,说明曲线拟合良好。并且U251人脑胶质瘤细胞与ZnPcS4-BSA孵育4h后摄取ZnPcS4-BSA的量达到峰值。
　　 3.单用不同浓度ZnPcS4-BSA处理细胞而不给激光辐射,各组间的细胞生存率差异没有显著性意义。
　　 4.在U251人脑胶质瘤细胞的培养中不加入ZnPcS4-BSA,而单纯给予不同剂量的激光辐射,不同剂量组的细胞存活率经各组间LSD分析发现最高剂量组(400 J/cm2)细胞生存率低于其他各组(P<0.001),其他各组比较无统计学差异。
　　 5.固定光敏剂浓度为30μmol/L,分别给予不同剂量激光照射,随着激光剂量的增加,细胞生存率降低。
　　 6.固定激光剂量为200 J/cm2,给予不同浓度ZnPcS4-BSA进行光动力反应。随着光敏剂浓度增加,细胞抑制率增加,IC50为0.16mmol/L。
　　 7.流式细胞术检测细胞凋亡,发现与未处理组相比,PDT组凋亡比率升高,有显著差异(P<0.01)。光镜下见肿瘤细胞数量大幅减少,残留肿瘤细胞失去正常形态,胞体皱缩,胞浆颜色变浅,细胞核固缩,培养皿内杂质增多。
　　 8.经过PDT组的U251人脑胶质瘤细胞VEGF基因表达是未处理组的5.29倍,有显著性差异(P≤0.05)。
　　 结论:
　　 1.ZnPcS4-BSA介导的对U251人脑胶质瘤细胞的光动力学治疗的最佳时间应该是用药后4小时。
　　 2.ZnPcS4-BSA本身对U251人脑胶质瘤细胞没有明显毒性作用。
　　 3.在低于200 J/cm2激光剂量范围内,单纯激光辐射不会损伤U251人脑胶质瘤细胞,过高剂量激光则会杀伤U251人脑胶质瘤细胞。
　　 4.在ZnPcS4-BSA介导的对U251人脑胶质瘤细胞的光动力治疗中,最佳的激光剂量为200 J/cm2。
　　 5.在ZnPcS4-BSA介导的对U51人脑胶质瘤细胞的光动力治疗中,随着ZnPcS4-BSA浓度增加,U251人脑胶质瘤细胞的抑制率增加。半数抑制浓度IC50为0.16mmol/L。
　　 6.ZnPcS4-BSA介导的PDT能通过诱导凋亡产生肿瘤治疗作用。
　　 7.ZnPcS4-BSA介导的PDT能诱导VEGF基因表达增加。
　　 第二部分:新型光敏剂ZnPcS4-BSA对荷瘤裸鼠的体内光动力杀伤效应及其机制研究
　　 目的:建立U251人脑胶质瘤裸鼠模型,探讨新型光敏剂ZnPcS4-BSA介导的光动力疗法对胶质瘤的体内光动力杀伤效应,并分析其对胶质瘤的杀伤机制,为其将来的临床应用奠定理论基础。
　　 方法:
　　 1.将U251人脑胶质瘤细胞株按常规传代、培养,将含有1×108个U251人脑胶质瘤细胞的悬液0.2ml接种于裸鼠左侧腋部皮下,接种后继续于SPF条件下饲养,当肿瘤直径长至0.6～0.8cm时,开始进行实验。
　　 2.30只裸鼠随机平均分成5组,荷瘤对照组不作任何处理；单纯光照组只给波长为670nm、剂量为200 J/cm2激光照射；单纯光敏剂组):只尾静脉注射光敏剂ZnPcS4-BSA,剂量为2 mg/kg,不光照,避光24小时；低剂量光动力组):尾静脉注射光敏剂ZnPcS4-BSA,剂量为1 mg/kg,避光4小时后,用波长为670nm、剂量为200 J/cm2的激光照射,再避光20小时；高剂量光动力组):尾静脉注射光敏剂ZnPcS4-BSA,剂量为2 mg/kg,避光4小时后,用波长为670nm、剂量为200 J/cm2的激光照射,再避光20小时。每周重复1次,连续3次后处死裸鼠,切除肿瘤,测量瘤体体积和瘤重,计算抑瘤率。各组肿瘤标本HE染色,光镜下观察。
　　 3.免疫组化测定不同组别肿瘤组织的VEGF表达,光镜下观察VEGF表达阳性的细胞并计数。
　　 4.光镜下检测平均血管密度(MVD)并计数。
　　 5.TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数,光镜下观察。
　　 6.数据采用SPSS17.0软件包进行统计分析。结果以均数±标准差表示,各组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,以P≤0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.动物模型成功建立,成瘤率100％。
　　 2.荷瘤对照组和单纯光照组、单纯光敏剂组的肿瘤体积相比,无统计学意义(P>0.05)；高剂量PDT组和低剂量PDT组肿瘤体积与荷瘤对照组比较有统计学差异(P≤0.05)。荷瘤对照组和单纯光照组、单纯光敏剂组的瘤重相比,无统计学意义(P>0.05)；高剂量PDT组和低剂量PDT组的肿瘤瘤重与荷瘤对照组比较,有显著性差异(P≤0.05)。低剂量PDT组和高剂量PDT组的抑瘤率分别为57.488％和67.150％,显著高于单纯光照组合单纯光敏剂组。
　　 3.PDT治疗后光镜下见肿瘤细胞生长密度降低,胞体体积变小,胞核固缩,坏死多见。
　　 4.与荷瘤组比,单纯光照组和单纯光敏剂组的VEGF和MVD表达差异均无统计学差异,低剂量PDT组和高剂量PDT组与对照组的VEGF和MVD表达比较均有统计学意义,低剂量PDT组和高剂量PDT组之间VEGF与MVD表达的比较有统计学意义。MVD水平随着VEGF表达的增强而增加,其相关系数为r=0.999,P<0.001。
　　 5.单纯光照组、单纯光敏剂组和荷瘤对照组凋亡指数比较无统计学差异接近(P>0.05)；高低剂量PDT组与荷瘤对照组比较有显著差异(P≤0.05),高剂量PDT组和低剂量PDT组比较有统计学差异(P≤0.05)。光镜下见PDT后出现较多的凋亡细胞。
　　 结论:
　　 1.在光敏剂ZnPcS4-BSA对U251人脑胶质瘤的体内PDT中,可以成功制出裸鼠人脑胶质瘤移植瘤的模型。
　　 2.光敏剂ZnPcS4-BSA本身无能量辐射时不会被激活发生光动力反应,产生细胞毒作用；单纯给予荷瘤裸鼠激光照射无法抑制肿瘤生长；单纯光敏剂ZnPcS4-BSA对荷瘤裸鼠没有明显毒性作用；在一定范围内,光敏剂ZnPcS4-BSA的PDT抑瘤效果随着光敏剂剂量的增加而增强。
　　 3.光敏剂ZnPcS4-BSA在PDT后肿瘤组织中VEGF表达在PDT后升高,其机制可能与PDT引发缺氧有关。在U251人脑胶质瘤新生血管形成中随着VEGF表达的增强,MVD也逐渐增加。
　　 4.在光敏剂ZnPcS4-BSA对荷U251人脑胶质瘤裸鼠的PDT中,存在诱导肿瘤细胞凋亡这一机制。