三种检测方法对乙型肝炎病毒血清标志物的比较研究

摘要

研究背景和目的：
　　 全球有超3.5亿人口感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV),而中国是一个HBV感染的大国,感染率约7.18％。肝细胞癌(HCC)在癌症死亡率中已跃升为第四位,男性患者是第三位,而HBV就是其主要病因。目前HBV血清学标志物(Hepatitis B Virus Serological markers,HBV-M)的检测普遍采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法。近来出现了时间分辨荧光分析技术(Time resolved fluorescence immunoassay,TRFIA)与化学发光免疫分析技术(Chemiluminescence Immunoassay,CLIA)检测HBV-M(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)；在HBV-M检测领域还有免疫胶体金技术(Colloidal goldimmunoassay,CGIA),放射免疫技术(Radioimmunoassay,RIA),等等。ELISA其优点是经济,成批检测时间不长,仪器设备要求不高,但准确性较差,且不能定量；TRFIA方法其优点是可定量,灵敏度与特异性较ELISA优越,但其检测时间较长,标本消耗量大；CLIA方法其优点是检测时间短,灵敏度与特异性高,但需配套的仪器设备与试剂,检测成本高；CGIV方法其优点是快速、不需仪器设备、单份测试成本低,但其灵敏度较低,难以进行质量控制；RIA方法其优点是灵敏度高,经济,但存在放射性污染。方法较多,不同的检测方法得出的结果有所差异,其差异随着人们对自身健康的关注而引起的医疗纠纷表现越来越突出。如乙肝病毒表面抗原(HBsAg)假阴性产生的输血安全问题,还有的问题如人们还没有意识到已感染HBV与肝炎,而未采取干预措施,如减少饮酒注意休息等一般措施和采取抗病毒治疗等特殊措施等从而发展为肝硬化肝癌等。如表面抗原为假阳性产生的最大问题是会使受检者加重心理负担,影响到婚姻、就业、家庭等。
　　 HBV的防治方案的合理选择,有赖于HBV血清标志物检测的准确。我国目前检测HBV-M主要有ELISA、TRFIA、电化学发光免疫分析(Electricalchemiluminescence Immunoassay,ECLIA)三种方法,因此,我们对三种方法的灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率、检测时间、标本消耗量等的比较来阐述三检测方法对HBV各血清标志物检测差异的程度及因为,从而分析各检测方法的优劣与应用价值；并基于我国目前实际情况探讨ELISA方法检测HBsAb的S/CO比值应用于免疫保护范围,以及ELISA测定低浓度nasAg的函数判断结果的准确性。总之,只有HBV-M结果准确,才有更科学个性化的防治方案,使易感者得到有效保护,乙肝感染者能延缓肝硬化肝肿瘤的病程进展、甚至治愈。
　　 方法：
　　 1.ECLIA、TRFIA、ELISA三种方法测定HBV血清标志物差异性比较
　　 452例标本来自2009年10月～2009年12月来我院就诊人员,其中男267例,女185例,年龄O岁～86岁,均龄41.2岁。第一部分来自分子生物学实验室(90例,均为肝炎患者,且已知FQ-HBV-DNA定量的结果),采取三种方法平行检测HBV-M。第二部分来自免疫定量实验室(182例),检测顺序为ECLIA、ELISA、TRFIA。第三部分来自免疫定性实验室(180例),检测顺序为ELISA、ECLIA与TRFIA平行检测。操作及结果判断严格按照说明书进行。ELISA以S/CO比值表示其量化程度,ECLIA的HBsAb为定量数据,其单位为mIU/ml；HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb四项则以COI(Cutoff index)指数来衡量量化程度,TRFIA测定结果均为定量结果,HBsAg的单位是ng/ml,HBsAb的单位是mIU/ml,HBeAg、HBeAb、HBcAb三项的单位是PEI U/ml。TRFIA、ELISA采用卫生部临检中心的质控品加强质量控制,而ECLIA以厂家的原装配套质控品加强质量控制。对三种方法检测HBsAg结果不一致的17例标本再采用表面抗原确认试剂以及采用HBV荧光PCR定量(FQ-HBV-DNA)再行确认。接着对ECLIA阴性、TRFIA阳性、FQ-HBV-DNA阳性的5例标本再采用Roche与Abbott两公司的ECLIA方法复查以确认是否为标本受到污染抑或为ECLIA检测突变能力以外的新突变体。
　　 2.ELISA方法S/CO比值应用于乙肝病毒表面抗体保护范围初探
　　 756例标本来自2008年8月～2009年10月我院查体人员,男480例,女276例,年龄0岁～86岁,均龄41.04岁。每份标本均用ELISA测定HBsAb,ECLIA测定HBsAb与HBsAg。操作及结果判断严格按照说明书进行；前者以S/CO比值表示其量化程度,≥1判为阳性,后者可直接定量,≥10IU/L判定为阳性。ELISA以10IU/L、30IU/L的HBsAb质控品加强质量控制,ECLIA以配套质控品加强质量控制。并以ECLIA为标准来评价ELISA测定HBsAb的特异性、灵敏度及其相关性。
　　 3.ELISA测定低浓度乙肝病毒表面抗原结果准确性函数判断
　　 收集2009年10月～2009年12月ELISA检测HBsAg的S/CO比值位于0.5～5.0之间的170份标本,23份组合模式奇特且HBsAg的S/CO比值≤11.0的标本(男125例,女68例,年龄0～81岁,均龄41.4岁,其中10例为新生儿)。COBASe601平台检测HBsAg后,置-20℃低温冰箱保存。标本收集完毕后从ECLIA复查HBsAg阳性中随机抽取40例作表面抗原中和确认实验。分析ELISA测定HBV-M的组合模式；并以HBsAg为因变量,ELISA测定的HBV-M五项以及年龄、性别为自变量进行多因素Logiest回归,得出回归方程。根据回归方程计算的P值从而初步判断ELISA方法测定HBsAg的结果是否准确。
　　 4.统计学方法
　　 采用Excel电子表格软件进行数据登记,SPSS16.0统计分析软件进行分析。ELISA、TRFIA、ECLIA检测HBV-M的阳性率其差异采用Pearson卡方检验,两两比较则采用partitions of x2 method,一致性检验检验采用Kappa检验。
　　 ELISA和ECLIA测定同一份标本的HBsAb结果配对,其差异采用McNemar卡方检验,一致性检验检验采用Kappa检验,相关性分析采用直线回归。
　　 ELISA和ECLIA测定同一份标本的HBsAg结果配对,其差异采用McNemar卡方检验,一致性检验检验采用Kappa检验；再以ECLIA测的HBsAg为因变量、ELISA测定的HBV-M为自变量进行Logiest回归。
　　 检验水准a=0.05。
　　 结论：
　　 1.ELISA与TRFIA检测HBsAg具有一定的假阳性和假阴性,但三种检测方法检测的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；三种方法检测HBsAb与HBeAg的阳性率差异无统计学意义(P>0.05);而HBeAb、HBcAb的阳性率有统计学差异(P<0.05)。
　　 2.与ECLIA相比,ELISA测定的HBsAb具有肯定的免疫保护作用的S/CO比值为大于13.0；不具有免疫保护作用的S/CO比值为<5.0。
　　 3.在没有ECLIA复查ELISA测定低浓度HBsAg的情况下,可利用函数求出的P值推断结果的准确性,以P=0.5为临界点,P值越大,阳性预测准确度越高,P值越小,阴性预测准确度越高。
　　 创新点：
　　 1.首次提出ELISA测定HBsAb的S/CO值可半定量,人们可据HBsAb检测S/CO值的范围,初步判定是否需重新或加强免疫,使ELISA的检测结果具有ECLIA定量的初步价值。
　　 2.首次提出ELISA测定低浓度HBsAg标本初步判断结果准确性的数学函数表达式。

目录

文摘

英文文摘

前言

参考文献

第一章 ECLIA、TRFIA、ELISA三种方法测定HBV血清标志物差异性比较

1.1 对象与方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 参考文献

第二章 ELISA测定HBsAb具有免疫保护作用范围初探

2.1.对象与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 参考文献

第三章 ELISA测定低浓度乙肝病毒表面抗原结果准确性的函数判断及临床意义

3.1 对象与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 参考文献

全文小结

研究论文总结

本研究的重要意义

课题的创新之处:

后续研究设想

附录

1 、缩略词

2 、随机数产生程序

3 、依据Logiest回归方程HBsAg的数理推断

文献综述

参考文献

研究成果

致谢

研究生毕业论文统计学审稿证明