ALDH1可能作为肺癌干细胞的功能性标志物

摘要

背景:
　　 肿瘤干细胞学说认为肿瘤起源于肿瘤干细胞,是正常干细胞累积突变的结果。肿瘤组织由异质性的细胞群体组成,其中存在极少量肿瘤细胞,具有正常干细胞相似的特性——自我更新的能力和多向分化的潜能,是肿瘤增殖生长、转移和复发的根源。目前认为肿瘤干细胞具有以下几个生物学特性:(1)肿瘤组织中的极少量肿瘤细胞,具有肿瘤细胞再生能力并促成肿瘤的异质性。肿瘤干细胞由于具有干细胞的自我更新和分化特性,一方面自我更新产生肿瘤干细胞,另一方面分化为子代细胞。(2)具有多重耐药性和对射线抵抗性。(3)具有恶性肿瘤早期微转移能力。肿瘤干细胞可以通过分泌信号分子等机制营造适于其分化、增殖的微环境,在一个完全不同于原位肿瘤的微环境中存活。(4)具有与肿瘤细胞和正常干细胞相关的信号传导通路。(5)表达与正常干细胞、肿瘤细胞和干细胞相关的分子标记。现今,人们已成功的从急性髓性白血病,多发性骨髓瘤,乳腺癌,脑肿瘤,非小细胞肺癌,黑色素瘤,前列腺癌和膀胱癌等多种类型的肿瘤患者组织中分离并培养出各自的肿瘤干细胞。
　　 肺癌是全世界发病率最高的恶性肿瘤,占恶性肿瘤相关死亡原因的第一位。绝大部分的肺癌患者最后终因肿瘤的复发、转移而死亡,克服和延缓肿瘤的复发、转移将是提高肺癌生存期的重要手段。而肿瘤复发转移的关键问题是由于肿瘤细胞的耐药。人们对肿瘤细胞耐药性的问题进行了广泛的研究,提出了不同的理论,包括:药物的转运或摄取过程障碍；药物的活化障碍；靶酶质和量的改变；增加利用内在的代谢途径；分解酶增加；修复机制增加；特殊的膜糖蛋白增加使细胞排除药物增多；DNA链间或链内交联减少；激素受体减少或功能丧失等等,这些理论虽然从不同的角度解释肿瘤细胞的耐药问题,但均具有一定的局限性和片面性,不能完全解释肿瘤细胞耐药的所有问题。近年来,肿瘤干细胞理论的提出,可以很好的解释肿瘤细胞的耐药问题,受到学术界的广泛关注。肿瘤干细胞已成为肿瘤研究的热点。但是肿瘤组织中肿瘤干细胞的数量极少,如何分离和鉴定这群细胞,对肿瘤干细胞的研究起到至关重要的作用。
　　 通常肿瘤干细胞的分离和鉴定主要是基于肿瘤干细胞特征性的表面标志物、肿瘤细胞体外培养特性、SP细胞特性、干细胞含有永生化DNA链特性及动物致瘤试验来。但是由于肺癌肿瘤干细胞尚缺乏特异性的表面标志物,因此肿瘤干细胞的分离纯化一直是长久以来亟待解决的难题之一。
　　 乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrog enase1,ALDH1,ALDH1A1或RALDH1)是乙醛脱氢酶(ALDH)家族之一,是催化细胞内乙醛氧化为乙酸的细胞溶质酶。通过氧化视黄醇为视黄酸参与基因的表达和组织分化。乙醛脱氢酶1在人体各种组织中都有表达,在维持正常组织的发育和内环境的稳定中发挥重要作用,发现其在免疫细胞中也表达。Chute等报道,ALDH1可能在干细胞的早期分化中有重要作用。人类的ALDH1基因表达存在于细胞质中,其基因克隆和定位在9q21染色体,由53×103个碱基对构成,包含13个外显子,共编码501个氨基酸序列,无重复序列,N’端为蛋氨酸M(Met),具有一个谷氨酸(Glu)和一个半胱氨酸(Cys)激活位点,其基因启动区包含一个ATA盒和一个CCAAT盒,分别位于转录起始部位上游的32 bp和74 bp处。综合近年来关于ALDH1与肿瘤干细胞的各项研究结果表明,ALDH1在多种组织类型的肿瘤干细胞呈高表达,而高表达ALDH1的细胞具有干细胞的特性。目前,以ALDH1活性作为功能性标志物已成功运用于乳腺癌、视网膜母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌等实体瘤的肿瘤干细胞的分离和鉴定。最近国外研究发现,ALDH1是肺癌肿瘤干细胞的功能性标志物,ALDH1+肺癌细胞具有干细胞的生物学功能。
　　 本实验主要研究肺癌A549细胞株ALDH1+细胞的体内外生物学功能,以及与一些干细胞表面标志物之间的相互关系,分析其是否具有肿瘤干细胞特性,建立一个检测和分离肺癌干细胞的方法和平台。为继续深入探讨肺癌的病因、发生、发展、转移、复发、耐药以及寻求干预肿瘤进展乃至治愈肿瘤的新方法等奠定基础。
　　 方法:
　　 一.细胞的分选
　　 利用Aldefluor试剂盒及流式细胞仪分选出ALDH1+细胞及ALDH1-细胞。Aldefluor荧光试剂可将ALDH的底物BAAA转化为BAA,该产物滞留在细胞内使ALDH活性高的细胞呈现出明亮的荧光标记。阴性对照管由于加入ALDH抑制剂DEAB,不能出现荧光标记。再通过流式细胞仪进行分选。
　　 二.ALDH1+细胞的生物学功能分析
　　 1.肿瘤球培养将ALDH1+细胞、ALDH1-细胞及未经分选的A549细胞均采用无血清悬浮培养法,观察肿瘤球形成情况。肿瘤球培养基配方为:DMEM-F12+B27+EGF(20ug/ml)+bFGF(20ug/ml)。
　　 2.通过平板克隆形成实验及MTT生长曲线法比较ALDH1+细胞、ALDH1-细胞及未经分选的A549细胞体外的自我更新与增殖克隆能力。
　　 3.Transwell实验分析ALDH1+细胞、ALDH1-细胞及未经分选的A549细胞的体外迁移能力。
　　 4.裸鼠体内成瘤实验:A549细胞处于对数生长期时,消化、流式细胞仪分选ALDH1+细胞和ALDH1-细胞,显微镜下计数ALDH1+、细胞未经分选的A549细胞和ALDH1-细胞各1000,5000,1×104,1×105个皮下注射裸鼠,3种细胞均按4个细胞数量组注射于裸鼠的大腿部皮下3个不同部位,观察成瘤情况。
　　 三.Real-time PCR检测CD133和CD44基因在ALDH1+细胞和ALDH1-细胞的mRNA表达水平。
　　 结果:
　　 一.Aldefluor流式分选结果
　　 流式细胞仪分选结果显示,ALDH1+细胞群在A549肺癌细胞株中所占的比例很低,仅为2.000±0.265％。
　　 二.ALDH1+细胞的生物学功能分析
　　 1.肿瘤球形成能力分析
　　 肿瘤球形成能力分析结果显示:ALDH1+细胞组的肿瘤球数目为56.00±8.000个,A549细胞组为16.6±1.528个,ALDH1-细胞组为6.33±1.528个。三组细胞之间的肿瘤球形成能力差异有统计学意义(F=90.015,P<0.001)。经LSD检验,与ALDH1+细胞相比,未分选A549细胞和ALDH1-细胞形成肿瘤球数均减少,差异有统计学意义(P值均小于0.001)。同时未分选A549细胞和ALDH1-细胞形成肿瘤球数差异也具有统计学意义(P=0.038)。ALDH1+细胞的肿瘤球形成能力强于未经分选的A549细胞高于ALDH1-细胞。
　　 2.自我更新和自我增殖能力分析
　　 MTT法检测结果显示,ALDH1+细胞的自我更新和自我增殖能力大于未经分选的A549细胞大于ALDH1-细胞,OD比值的差异具有统计学意义(F=22.079,P<0.001)。平板克隆形成实验结果,ALDH1+细胞所形成的克隆数及克隆的大小均大于未经分选的A549细胞及ALDH1-细胞。ALDH1+细胞的克隆形成率为39.833±2.363％,未经分选的A549细胞的克隆形成率为22.833±3.253％,ALDH1-细胞的克隆形成率为12.5±0.100％,三组细胞形成克隆数之间的差异具有统计学意义(F=99.864,P<0.001)。经LSD检验,与ALDH1+细胞相比,未分选A549细胞和ALDH1-细胞形成克隆球数均减少,差异有统计学意义(P值均小于0.001)。同时未分选A549细胞和ALDH1-细胞形成克隆数差异也具有统计学意义(P=0.002)。同样显示ALDH1+细胞的自我更新和自我增殖能力大于未经分选的A549细胞大于ALDH1-细胞。
　　 3.体外迁移能力分析
　　 Transwell实验结果表明,ALDH1+细胞组穿过小室膜的细胞数为139.20±14.025个,未经分选的A549细胞组为31.00±5.701个,ALDH1-细胞组为10.80±2.864个,三组细胞穿过小室膜的细胞数之间差异具有统计学意义(F=301.199,P<0.001)。经Dunnett's T3检验,与ALDH1+细胞相比,未分选A549细胞和ALDH1-细胞穿过膜的细胞数均减少,差异有统计学意义(P值均小于0.001)。同时未分选A549细胞和ALDH1-细胞穿过膜的细胞数差异也具有统计学意义(P=0.001)。ALDH1+细胞迁移能力高于未经分选的A549细胞高于ALDH1-细胞。
　　 4.裸鼠成瘤实验分析
　　 注射1000个细胞时,ALDH1+细胞组、未经分选的A549细胞组及ALDH1-细胞组均未见肿瘤形成；注射5000个细胞时,8周后ALDH1+细胞组有1个注射部位形成肿瘤,未经分选的A549细胞组及ALDH1-细胞组未见肿瘤形成；注射1×104个细胞时,6周后ALDH1+细胞组3个注射部位均有肿瘤形成,未经分选的A549细胞组及ALDH-细胞组未见肿瘤形成；注射1×105个细胞时,6周后ALDH1+细胞组3个注射部位均有肿瘤形成,未经分选的A549细胞组有2个注射部位有肿瘤形成,ALDH1-细胞组未见肿瘤形成。
　　 三.Real-time PCR检测CD133和CD44基因在ALDH1+细胞和ALDH1-细胞的mRNA表达结果
　　 Real-time PCR的结果表明干细胞膜表面标志物CD133的表达在ALDH1+细胞高于ALDH1-细胞,差异具有统计学意义(t=18.055,P<0.001)；CD44的表达也是ALDH1+细胞高于ALDH1-细胞,差异具有统计学意义(t=32.362,P<0.001)。
　　 结论:
　　 1.通过体外实验证实A549细胞株中ALDH1+细胞具有自我更新,自我增殖和迁移能力。体内试验证实ALDH1+细胞具有高致瘤能力。提示ALDH1+A549细胞具有肿瘤干细胞特性。ALDH1可能作为分选肺癌干细胞的标志物。
　　 2.ALDH1+A549细胞高表达干细胞膜表面标志物CD133和CD44。进一步证实ALDH1+细胞可能是肺癌干细胞。