TP53、BIRC7、ANXA1和ENO1血清自身抗体在肺癌诊断与预后判断上的应用

摘要

背景：肺癌在世界范围内均是死亡率和发病率最高的恶性肿瘤。肺癌的发病率与香烟的流行关系密切,发达国家肺癌发病率明显高于发展中国家。由于发达国家对于香烟的限制措施,肺癌的发病率已进入平台期,死亡率正在下降。临床实践证实肺癌是可治愈的疾病,IA肺癌五年生存率为60％～80％,ⅡA及ⅡB期患者为40％～50％。肿瘤出现局部、区域、远处转移的患者五年生存率分别为49％、16％、2％。据统计2/3的初诊患者已经为晚期,失去了手术治愈的机会,这导致肺癌整体人群总生存率不超过16％。近期研究发现通过对早期肺癌的筛查,可以提高肺癌的总生存率。因此,在不断寻求治疗手段提高生存的基础上,进行肺癌早期筛查才能提高疾病整体的预后。目前肺癌的筛查手段缺乏足够的敏感性和特异性,寻找简单、经济、准确的诊断技术一直都是研究的热点。
　　 肿瘤相关抗原是肿瘤发生、进展过程中细胞坏死释放、脱落或者外分泌的特异蛋白产物,其与人体免疫系统相互作用可产生特异性自身抗体。自身抗体不仅具有免疫监视、免疫预防和免疫反应的作用,同时由于其在循环系统中稳定的丰度,所以也可能作为早期诊断的标志物。但是经过大量的研究发现,单个标志物的敏感性和特异性不足以满足肺癌筛查,多个标志物组合是获取高敏感性和高特异性诊断的手段。目前常用的自身抗体检测技术包括酶联免疫吸附实验、噬菌体展示技术、血清蛋白组学分析及蛋白芯片等常见方法,多种方法的应用丰富了自身抗体表达的水平的检测手段。尽管如此,大多数自身抗体诊断模型的研究还没有得到有效的验证,限制了其在临床应用的进一步发展。
　　 回顾性的分析显示,大多数肿瘤相关抗原参与了细胞周期调控、增殖分化、凋亡抑制、血管生成、肿瘤转移及能量代谢等肿瘤细胞赖以生存的信号通路,其表达水平以及其血清自身抗体的水平与疾病预后可能存在相关性,因此血清自身抗体不仅具有诊断价值同时也具有预后价值。
　　 之前的研究我们已经使用真核表达系统成功表达了10个肿瘤相关抗原,应用这些TAAs与肿瘤自身抗体的检测,我们构建了4个自身抗体的组合,该组合诊断肺癌的敏感性93％,特异性92％。本研究拟筛选出独立样本对学习集的诊断模型进行验证,同时也进一步研究其与临床预后的关系,为个体化治疗寻求新的靶标打下理论基础。
　　 目的：本研究目的为利用4个肿瘤相关抗原检测初治肺癌患者及对照组血清,分析肺癌患者相关临床因素对自身抗体表达的影响,评估相应的血清自身抗体单独或联合应用对肺癌的诊断价值。评价学习集自身抗体组合的诊断价值。进一步探索血清标志物的预后价值。
　　 方法：应用真核连续交换表达系统表达成功的TP53、BIRC7、ANXA1、ENO1纯化蛋白做为包被溶液,建立间接法ELISA并检测116例初治肺癌患者、38例对照组(健康自愿者及良性疾病患者)血清,获取受试者血清自身抗体的光密度值(OD值)。以“对照组平均OD值+2×标准差”及“对照组平均OD值+3×标准差”作为截断值计算TP53、BIRC7、ANXA1、ENO1各自身抗体的敏感性和特异性,描绘ROC曲线及算出AUC。根据广东省人民医院电子病历系统收集肺癌患者临床相关信息(年龄、性别、体力评分状态、吸烟等级、肿瘤大小、TNM分期、治疗方案及总生存时间),分析临床参数与自身抗体之间的关系。
　　 统计方法:使用独立样本t检验比较两组样本的平均数,三组以上的平均数的比较采用单因素方差分析(One—Way ANOVA),均数比较如果不满足方差齐性,则采用非参数检验。率的比较采用卡方检验。描绘每个自身抗体的ROC曲线,以曲线下面积评价其诊断肺癌的价值,曲线下面积之间比较采用Z值检验。利用logistic回归构建诊断肺癌模型。Kaplan—meier法及log-rank test分析单因素与非小细胞肺癌患者预后的关系。多因素COX回归分析肺癌患者临床因素及自身抗体表达是否为独立预后因子。所有统计分析采用SPSS13.0软件,P<0.05认为差异具有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.肺癌患者血清中TP53(t=7.575,P=0.000)、BIRC7(t=8.094,P=0.000)、ANXA1(t=8.015,P=0.000)、ENO1(t=10.685,P=0.000)自身抗体OD值比对照组血清中相应自身抗体OD值明显增高。肺癌患者中不同年龄、性别、吸烟量、体力状态、病理类型、临床分期之间TP53、BIRC7、ENO1自身抗体水平差异没有统计学意义。不同性别、吸烟量、体力状态、病理类型、临床分期之间ANXA1自身抗体水平差异没有统计学意义。年龄小于61岁肺癌患者ANXA1自身抗体表达水平显著高于年龄大于61岁者(t=2.106,P=0.039)。
　　 2.在腺癌患者血清中TP53(r=0.444,P=0.005)、BIRC7(r=0.335,P=0.040)、ANXA1(r=0.426,P=0.008)自身抗体的水平与肿瘤大小具有相关性,ANXA1血清自身抗体OD值与鳞癌原发肿物最大径相关(r=0.327,P=0.042)。
　　 3.以ODavg+2SD为截断值时TP53特异性在学习集中下降(x2=30.390,P=0.000)差异有统计学意义,BIRC7敏感性提高(x2=9.834,P=0.002)差异具有统计学意义,其特异性下降(x2=6.569,P=0.010)差异具有统计学意义,ANXA1敏感性提高(x2=9.328,P=0.002)差异具有统计学意义；以ODavg+3SD为截断值时,TP53特异性在学习集中下降(x2=6.752,P=0.009)差异有统计学意义。无论ODavg+2SD还是ODavg+3SD为截断值ENO1诊断肺癌的敏感性和特异性在学习集和验证集中差异没有统计意义。
　　 4.以TP53、BIRC7、ANXA1、ENO1 OD值建立受试者工作特征曲线,其曲线下面积分别为0.83(95％CI=0.77～0.90)、0.84(95％CI=0.77～0.91)、0.86(95％CI=0.80～0.93)、0.90(95％CI=0.85～0.95)。TP53诊断肺癌ROC曲线下面积在学习集与验证集之间差异具有统计学意义(Z=3.598,P=0.000),而BIRC7、ANXA1、ENO1在学习集与验证集之间的ROC曲线下面积差异没有统计学意义。
　　 5.利用学习集中四个自身抗体相互组合获得八个logistics回归模型曲线下面积,在本验证集中曲线下面积分别为为0.823,0.828,0.836,0.877,0.847,0.867,0.889,0.893。比较学习集与验证集的数据,模型一、二、三、五、六ROC曲线下面积差异有统计学意义(均有P=0.000),而模型四、模型七、模型八差异无统计学意义；在敏感性上,模型一、模型三、模型六、模型八学习集和验证集差异具有统计学意义,模型二、模型四、模型五、模型七差异无统计学意义；在特异性上,模型一、二、三、五、六、七、八学习集和验证集差异有统计学意义,仅模型四差异无统计学意义。
　　 6.接受我院治疗的非小细胞肺癌中,单因素kaplan—Meier生存分析发现T分期(x2=8.681,P=0.034,Log—Rank test)、N分期(x2=12.894,P=0.005,Log—Ranktest,)、M分期(x2=11.143,P=0.001,Log—Rank test)、临床分期(x2=18.071,P=0.000,Log-Rank test)可能是总生存的预后因素。ENO1自身抗体表达水平(x2=3.775,P=0.052,Log-Rank test)及初诊时体重减轻程度(x2=3.572,P=0.059,Log-Rank test)可能与总生存相关。多因素COX回归分析显示临床分期(P=0.000,Hazard Ratio=2.502,95％Confidential Interval=1.598～3.924)是独立的预后因子。
　　 初步结论：
　　 1.在验证集的研究中,肺癌患者血清中TP53、BIRC7、ANXA1、ENO1自身抗体的表达明显高于对照组患者,其表达不受性别、吸烟、体力评分、吸烟等级、组织学类型及分期等因素影响。年龄不影响TP53、BIRC7、ENO1自身抗体的表达。但是年龄可能是影响ANXA1自身抗体表达的因素。
　　 2.在腺癌中,肿瘤大小可能是影响TP53、BIRC7、ANXA1自身抗体水平的因素,其自身抗体的表达水平随肿瘤原发直径的大小增大而升高,以TP53最为明显。鳞癌中肿瘤大小可能影响ANXA1自身抗体表达水平。
　　 3.ENO1自身抗体ROC曲线下面积和最佳截断值通过了学习集和验证集两个独立数据集验证,其ROC曲线下面积为0.917(学习集)、0.901(验证集)；以ODavg+2SD为截断值敏感性为70.8％(学习集)、78.4％(验证集),特异性94.8％(学习集)、92.1％(验证集);ODavg+3SD为阶段值敏感性为51.4％(学习集)、45.7％(验证集),特异性100％(学习集、验证集)。
　　 4.学习集中获得logistics回归模型Logit(P)=19.047YENO1+9.444YBIRC7-8.964YANXA1-4.691其诊断肺癌的ROC曲线下面积和最佳截断值经过学习集和验证集验证,其ROC曲线下面积为0.929(学习集)、0.877(验证集);敏感性为81.3％(学习集)、83.6％(验证集)；特异性为92.7％(学习集)、84.2％(验证集)。
　　 5.ENO1自身抗体可能与非小细胞肺癌患者预后相关。