二十二碳六烯酸联合5氟尿嘧啶对人肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用及其机制探讨

摘要

研究背景：
　　原发性肝癌（Primary liver cancer，PLC，以下简称肝癌）恶性程度高，自然生存期短，由于其发病隐匿，确诊时能够手术切除者仅占10％～20％，术后5年复发率高达70％，而单纯外科治疗一般无法从根本上解决肝癌复发的问题。临床上针对中晚期的肝癌主要以手术、介入治疗及大剂量化疗为主，但传统化疗药物的长期应用使肝癌细胞耐药现象越来越普遍，这大大影响了化疗药物的临床应用。因此，解决中晚期的肝癌化疗中的耐药问题和优化化疗方案显得尤为必要。
　　二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)属于ω-3多不饱和脂肪酸家族成员，大量研究表明，DHA能选择性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞的影响较轻，其作用机制涉及对肿瘤细胞增殖抑制、凋亡和分化诱导，对环氧化酶的抑制和脂质过氧化的影响，对抗癌免疫功能的调节等方面。
　　近年来研究发现，ω-3多不饱和脂肪酸不仅对多种恶性肿瘤均具有抑制作用，而且与具有明确抗癌效果的药物联合可达到增强抑瘤效应、降低化疗药物毒性和解决耐药等目的。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是消化系统恶性肿瘤的基本用药，是第一个用于肝癌治疗的系统性化疗药物，它对多种肿瘤有抑制作用。但5-FU的缺点是用药有效剂量与中毒剂量相近、药物的生物利用率低等。5-FU联合其他药物使用的效果比单独使用该药疗效要好，因此在联合化疗中应用较多。5-FU应用于联合化疗优点包括只需小剂量化疗药物就可以取得高效果，药物不良反应减少，耐药性降低，还可以降低化疗药物自身的毒性。因此，5-FU的联合化疗拥有更广阔的临床应用前景。
　　已有文献报道，DHA可在一定程度上抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡，但DHA联合5-FU应用于肝癌细胞的抑制增殖、诱导凋亡等方面是否具有明确抗癌协同作用，尚未完全明确。同时，DHA联合5-FU诱导肝癌细胞凋亡的分子机制值得进一步探讨。因此，本研究采用CCK-8法检测DHA、5-FU两药单用和联用对肝癌细胞HepG2增殖的影响;Annexin-V-PE/PI荧光双标记法检测DHA、5-FU两药单用和联用对HepG2细胞凋亡作用;Hoechst33258染色及JC-1线粒体膜电位检测观察HepG2细胞的凋亡及形态学变化。
　　Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡与抗凋亡信号转导通路中起着关键性作用。该家族中主要的抗凋亡基因是Bcl-2，而主要的促凋亡基因是Bax。有报道指出，Bcl-2和Bax的生物学特性及其在肝癌细胞HepG2中的作用、细胞凋亡的失控是导致肿瘤发生、发展的重要方面。肿瘤的发生与细胞内信息传递异常密切相关，而肝癌细胞的增殖受多条信号转导通路影响，有丝分裂原激活激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)是信号从细胞表面到细胞核内重要传递者。MAPK信号传导通路的异常，将导致细胞增殖与凋亡之间的失衡，可能在肝癌发病过程起作用。MAPK信号通路主要包括细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、应激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，c-JNK)和p38。ERK主要参与细胞的生长、增殖与分化，SAPK/JNK和p38主要参与炎性反应与凋亡。此外，近年来Caspases(cysteine aspartic acid specific protease)以执行细胞凋亡而受到广泛关注。在哺乳动物细胞，Caspase以依赖线粒体和非依赖线粒体两条途径促进细胞凋亡，Caspase-8在其中起重要作用，是细胞凋亡的启动者，被激活后可引起下游Caspase“瀑布式”激活，且可将凋亡信号从非依赖线粒体途径传递到线粒体途径，把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，放大凋亡信号。因此，在研究DHA联合5-FU诱导肝癌细胞凋亡的分子机制时，采用Western Blot方法检测5-FU单用或联合DHA对HepG2细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响，进而检测MAPK、Caspase-8等蛋白表达变化，初步揭示DHA增强5-FU疗效的机制，以期利用DHA通过不同通路协同化疗药物诱导细胞凋亡的特点，为DHA与5-FU在肝癌综合治疗研究领域提供理论依据和实验室基础。
　　目的：
　　1.DHA联合5-FU作用肝癌细胞在抑制细胞增殖、诱导凋亡等方面是否具有明确抗癌协同效果。
　　2.探讨DHA联合5-FU诱导肝癌细胞凋亡分子的机制。
　　方法：
　　1.CCK-8法检测细胞增殖
　　接种处理好的单细胞悬液于96孔板，每孔100μl DMEM完全培养基含3000个细胞，每组设6个复孔，不同处理时间后，加入CCK-8溶液10μl，继续培养2h后在450nm波长下，酶联免疫分析仪测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线，实验重复3次，所有数据以均数±标准差((x)±s)表示。
　　2.Annexin V-PE/PI荧光双标记法检测HepG2细胞的凋亡
　　用0.25％胰酶将细胞从培养瓶底消化下来，1200rpm离心5min，计数细胞;各组细胞以1×105/孔接种于6孔板，每组设3个复孔;接种培养24h后，细胞密度为80％，更换培养基，各孔加入5-FU或DHA诱导细胞凋亡，48小时后，用0.25％胰酶(不含EDTA)将六孔板上的细胞消化下来，PBS洗涤细胞两次，2000rpm离心5min，收集1×105～5×105细胞;吸取500ul1×BindingBuffer加入到细胞悬液里;然后加入5μl的Annexin V-PE和10μl的PI;室温、避光，反应5-15min;流式细胞仪检测细胞凋亡率。
　　3.Hoechst33258染色及JC-1线粒体膜电位检测观察HepG2细胞的凋亡情况
　　5-FU、DHA两药单用或联用处理细胞48小时后，固定10min。加入Hoechst33258染色液，0.3ml/孔，染色10min。倒置荧光显微镜下观察细胞核形态改变，400×视野下选择5个典型视野，每个视野计数200个细胞，计算每个视野凋亡核所占比率，记为该组细胞的凋亡率。
　　5-FU或5-FU联合DHA处理细胞48小时后，倒置荧光显微镜下观察细胞浆内线粒体膜电位的变化，200×视野下选择5个典型视野，每个视野计数200个细胞，计算每个视野红色荧光细胞所占比率。
　　4.Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及MAPK、Caspase-8蛋白表达变化
　　提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，配制10％蛋白电泳分离胶和5％积层胶，蛋白变性上样，上样量30μg，按照积层胶电压70V，分离胶电压100V电泳，待溴酚蓝指示剂迁移到凝胶底部时停止电泳。恒压20V，30min半干电转膜，5％的脱脂奶粉/TBS-T室温封闭1h，5％的脱脂奶粉/TBS-T1∶500稀释相应的一抗，与PVDF膜4℃孵育过夜，TBS-T洗涤，同样方法1∶3000稀释HRP标记二抗，室温1h，TBS-T洗涤后，ECL化学发光法检测，Quantity one(Bio-Rad)软件半定量分析。
　　5.统计学分析
　　数据以均数士标准差((x)±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，Hoechst染色和JC-1荧光染色结果采用Z2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.DHA联合5-FU对肝癌细胞HepG2的增殖抑制、诱导凋亡具有协同作用:
　　5ug/ml 5-FU单独处理组及5ug/ml 5-FU联合30ug/mlDHA组处理细胞24h、48h、72h后，增殖抑制率分别为:11.7±2.7％、24.4士3.9％、62.8±5.2％;13.7±2.1％、59.0±3.6％、85.3+2.7％。联合处理组细胞凋亡率较单独使用5-FU组明显增加，分别为23.74±3.20％、13.2±2.81％。Hoechst33258染色显示，5-FU联合DHA组细胞中出现明显的凋亡核表现，细胞凋亡率较单独采用5-FU及对照组细胞显著增高。JC-1线粒体膜电位检测结果显示，联合组细胞线粒体膜电位较单独使用5-FU组显著降低，提示DHA可能通过线粒体途径来诱导凋亡而增强5-FU的细胞毒效应。
　　2.5-FU单独或联合DHA均下调肝癌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达，增强Bax表达，抑制磷酸化ERK表达;5-FU联合DHA较单用5-FU对Bcl-2的抑制作用更，并能显著激活Caspase-8和JNK活性，抑制磷酸化ERK活性。
　　Western Blot检测结果显示，与对照组比较，5-FU单独或联合DHA均下调肝癌细胞凋亡相关蛋白的Bcl-2表达;与单用5-FU比较，5-FU联合DHA组Bcl-2表达受到明显的抑制。与对照组比较，联合组与单用5-FU组的Bax表达均增强。
　　与对照组比较，5-FU单独处理组HepG2细胞p-ERK表达下降，p-JNK、Cleaved Caspase-8表达增加，p-P38表达无变化。与单用5-FU组比较，5-FU联合DHA组对MAPK的影响，p-ERK明显受到抑制，而p-JNK表达显著增加，p-P38表达无差别;联合组Cleaved Caspase-8表达显著增加。
　　结论：
　　DHA联合5-FU对肝癌细胞的增殖抑制、诱导凋亡具有协同作用;两药联合可能通过下调Bcl-2表达、抑制磷酸化ERK及激活JNK、Caspase-8活性来诱导肝癌细胞凋亡。

目录

摘要

前言

材料和方法

1 材料

2 方法

结果

第一部分 DHA联合5-FU对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用

第二部分 DHA联合5-FU抑制肝癌细胞HepG2增殖的分子机制

讨论

全文小结

参考文献

中英文缩略词对照表

攻读学位期间发表的论文

致谢

声明

统计学证明