TGF-β1在雷奈酸锶促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中的作用

摘要

研究目的
　　 雷奈酸锶(Strontiumranelate，Sr)是一种用于治疗骨质疏松的新型药物，它具有使大鼠骨髓间充质干细胞(ratbonemarrowmesenchymalstemcells，rBMSCs)向成骨细胞方向转化的作用，除此之外，它还有改善骨强度，促进新生血管形成等其它重要的功能。研究表明Sr可通过细胞外信号调节激酶1/2(extracellularsignalregulatedkinase1/2，ERK1/2)和p38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信号通路调节成骨细胞特异性转录因子Runx2(Cbfal)的转录活性，Runx2则调节下游成骨基因，如骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、Ⅱ型胶原（CollagentypeⅡ，COLⅡ）的表达，促进BMSCs的成骨分化。
　　 转化生长因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)是属于转化生长因子-β（Transforminggrowthfactor-β，TGF-β）超家族成员之一，它有着极其广泛的生物学功能，不仅调控rBMSCs的生长发育和分化，而且能促进rBMSCs向成骨细胞的发育和转化，调控成骨细胞的生长发育和增殖，在合成骨基质和形成骨重建方面也起着重要的作用，是调控rBMSCs生长发育和向成骨细胞分化的首选的生长因子之一;它还可参与调控多种细胞的生长发育和生物学功能。相关资料表明，TGF-β1可能在锶促进rBMSCs向成骨细胞分化的过程中起着重要的作用。但是，TGF-β1在Sr促进rBMSCs向成骨细胞分化中的作用如何迄今未见报道。本文旨在重点探讨:①Sr对rBMSCs的TGF-β1表达的影响;②TGF-β1是否在Sr促进rBMSCs向成骨细胞分化中起作用，以便为Sr的促成骨作用机制提供新颖的实验资料。
　　 研究方法
　　 1.建立rBMSCs体外分离、培养的方法体系。
　　 取四周龄，雌雄不限SD大鼠，取出大鼠双侧的股骨，胫骨，用全骨髓贴壁的方法分离出rBMSCs，用含培养液的10ml注射器从大鼠骨髓中将rBMSCs从骨髓中冲洗出来，直至骨髓腔发白，将收集好的细胞悬液离心，去上清，置于25cm2培养瓶中，并于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱培养，当细胞铺满瓶底80％左右时进行传代培养和适当的冻存。并取第3-5代的细胞用于实验。用倒置显微镜观察细胞生长发育状态，并鉴定所培养的细胞为骨髓间充质干细胞。
　　 2.定向诱导rBMSCs向成骨细胞分化
　　 取生长状态良好的第3-5代rBMSCs，调整其浓度为105/ml左右，取细胞悬液4ml接种，并用成骨诱导液（含10-8的地塞米松，0.2mM的维生素C，10mMβ-甘油磷酸钠）培养，当细胞融合达到60％-70％时，进行实验操作。
　　 3.实验分组
　　 (1)碱性磷酸酶(ALP)指标测定的实验分组
　　 ①分为六组，分别设不同的浓度诱导rBMSCs，分别为对照组、Sr=0.1、Sr=1、Sr=3、Sr=5、Sr=7mM，每组设5复孔，六组均在成骨诱导液条件下诱导rBMSCs7天。当Sr=3mM时，ALP活性最大。
　　 ②分为五组，分别为对照组:成骨诱导液培养;Sr组:3mMSr+成骨诱导液培养;Sr+SB组:Sr+SB431542+成骨诱导液:先用10μmol/LSB431542(TGF-β1抑制剂)预处理rBMSCs2小时，然后加3mMSr;SB431542组:SB431542+成骨诱导液:先用10μmol/LSB431542预处理rBMSCs2小时;DMSO组:DMSO+成骨诱导液，用10μmol/LDMSO培养;共培养rBMSCs7天，测定ALP活性。
　　 (2)茜素红钙结节染色的实验分组
　　 ①分为两组，分别设不同的浓度诱导rBMSCs。对照组:用成骨诱导液培养;Sr组:3mMSr+成骨诱导液，共培养21天。
　　 ②分为五组，分别为对照组:成骨诱导液培养;Sr组:3mMSr+成骨诱导液;Sr+SB431542组:Sr+SB431542+成骨诱导液，先用10μmol/LSB431542预处理rBMSCs2小时，然后加3mMSr;SB431542组:SB431542+成骨诱导液:先用10μmol/LSB431542预处理rBMSCs2小时;DMSO+成骨诱导液组:用10μmol/LDMSO培养;共培养rBMSCs21天，测定钙结节数目。
　　 (3)TGF-β1蛋白表达的实验分组
　　 ①分为六组，分别设不同的浓度诱导rBMSCs。分为对照组、Sr=0.1、Sr=1、Sr=3、Sr=5、Sr=7mM六组，在成骨诱导液中培养7天。当Sr=1mM时，TGF-β1蛋白表达最高。
　　 ②分为六组，分别设不同的时间诱导rBMSCs。分为对照组、t=1、t=3、t=5、t=7、t=10天六组。各组中所用Sr=1mM。当t=7天时，TGF-β1蛋白表达最高。
　　 ③分为五组，分别为对照组:用成骨诱导液培养;Sr组:1mMSr+成骨诱导液;Sr+SB431542组:Sr+SB431542+成骨诱导液，先用10μmol/LSB431542预处理rBMSCs2小时，然后加1mMSr;SB431542组:10μmol/LSB431542+成骨诱导液:先用10μmol/LSB431542预处理rBMSCs2小时;DMSO组:DMSO+成骨诱导液，用10μmol/LDMSO培养;共培养rBMSCs7天，用western-blot检测TGF-β1蛋白表达情况。
　　 (4)Runx2mRNA表达情况分组
　　 ①分为六组，分别设不同的浓度诱导rBMSCs。对照组、Sr=1、Sr=2、Sr=5、Sr=7、Sr=10mM六组，在成骨诱导液中培养7天。当Sr=1mM时，Runx2mRNA表达最高。
　　 ②分为八组，分别设不同的时间诱导rBMSCs。对照组、t=0.5h、t=1h、t=2h、t=4h、t=3d、t=7d、t=14d。各组所用Sr=1mM。当t=7天时，Runx2mRNA表达最高。
　　 ③分为五组，分别为对照组:用成骨诱导液培养;Sr组:1mMSr+成骨诱导液;Sr+SB431542组:Sr+SB431542+成骨诱导液，先用10μmol/LSB431542预处理rBMSCs2小时，然后加1mMSr;SB431542组:10μmol/LSB431542+成骨诱导液:先用10μmol/LSB431542预处理rBMSCs2小时;DMSO组:DMSO+成骨诱导液，用10μmol/LDMSO培养;共培养rBMSCs7天，PT-PCR检测Runx2mRNA表达情况。
　　 研究结果
　　 1、大鼠骨髓间充质干细胞的形态学观察
　　 倒置相差显微镜观察显示:rBMSCs的接种初期可见大量圆形的悬浮细胞。随培养时间的延长，细胞形状渐趋向于多角形或梭形，大多数细胞在24小时之内贴壁，这一代细胞为原代细胞，当原代细胞培养至一星期左右时，细胞贴壁可达70％-80％;经过多次细胞换液后，我们发现细胞形态逐渐趋向一种，呈成纤维样细胞，当细胞逐渐融合之后，呈漩涡状、辐射状。当细胞融合至80％左右，应按1:2的比例传代。
　　 2、Sr增加rBMSCs的ALP活性
　　 应用浓度分别为0、0.1、1、3、5、7mM的Sr分别处理rBMSCs7天，测定ALP的OD值。应用单因素方差分析显示总体均数间有显著统计学差异(F=44.092，P＜0.001)，各组与对照组相比均能增加rBMSCsALP活性(P＜0.05)，其中当Sr的浓度为3mM时，rBMSCsALP活性的作用最大，与各组相比较均有统计学意义(P＜0.05);在用3mMSr处理细胞前2小时，应用10μmol/LSB431542预处理rBMSCs，共培养7天，测定ALP的OD值。应用单因素方差分析显示总体均数间有显著统计学差异(F=5.053，P＜0.001)。应用3mMSr处理细胞7天可明显增加ALP活性，与各组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)，在用3mMSr处理细胞前2小时，应用10μmol/LSB431542预处理rBMSCs，可明显地抑制Sr对ALP活性的促进作用，与Sr组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，对照组、SB431542组、DMSO组三组间无统计学意义(P＞0.05)。
　　 3、Sr促进rBMSCs的钙结节形成
　　 应用浓度分别为0、3mMSr分别处理rBMSCs21天。应用独立样本T检验显示当我们用3mMSr作用rBMSCs21天时，可明显增加钙结节数量，与对照相比较有统计学差异(t=-9.865，P＜0.001);在3mMSr处理rBMSCs前2小时，10μmol/LSB431542预处理细胞2小时，共培养21天。用单因素方差分析显示总体均数间有显著统计学差异(F=19.161，P＜0.001)，Sr组可明显增加钙结节的数量，与任意一组比较均有统计学意义(P＜0.05)，在3mMSr处理rBMSCs前2小时，10μmol/LSB431542预处理细胞2小时能明显地抑制Sr对钙结节形成的促进作用，两组相比有统计学差异(P＜0.05)，对照组、SB组、DMSO组三组间无统计学差异(P＞0.05)。
　　 4、Sr对rBMSCsTGF-β1蛋白表达的影响
　　 应用0、0.1、1、3、5、7mMSr分别处理rBMSCs7天。用单因素方差分析示总体均数间有显著统计学差异(F=583.858，P＜0.001)，0.1-5mMSr各组较均可显著地上调TGF-β1的表达，与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，其中当Sr浓度为1mM时，TGF-β1表达达到高峰，与各组相比有统计学差异(P＜0.05)，但当Sr=7mM时，Sr对TGF-β1表达无明显作用，与对照组比较，无统计学差异(P＞0.05);在1到10天的时间范围内，用1mMSr诱导细胞。用Welch校正法可知总体均数间有统计学差异(P＜0.001)，各组呈时间依赖性地促进TGF-β1表达，在第7天时TGF-β1表达达到高峰，与各组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)，第10天时Sr对TGF-β1的表达无明显增加，与对照组相比无统计学差异(P＞0.05);应用1mMSr处理rBMSCs前2小时，给予10μmol/LSB431542预处理，共培养7天。用单因素方差分析示总体均数间有显著统计学差异(F=314.375，P＜0.001)，其中1mMSr可明显的促进TGF-β1的表达，与其余各组比较，有显著统计学差异(P＜0.01)，加入SB431542后可明显地抑制Sr对TGF-β1表达的上调作用，两组相比有显著统计学差异(P＜0.01)，对照组、SB组、DMSO组三组间无统计学差异(P＞0.05)。
　　 5、Sr对rBMSCsRunx2mRNA表达的影响
　　 应用0、1、2、5、7、10mMSr分别处理rBMSCs7天。用单因素方差分析可知总体均数间有显著统计学差异(F=985.949，P＜0.001)，应用1-5mMSr时可显著地上调Runx2mRNA的表达，其中浓度为1mM时，Runx2mRNA表达达到高峰，与对照组相比有统计学差异(P＜0.01)，当Sr=7和Sr=10mM时，Runx2mRNA表达均明显下降，与对照组比较有统计学差异(P＜0.01);在0.5小时-14天的时间范围内，1mMSr培养细胞。用单因素方差分析可知总体均数间有显著统计学差异(F=353.551，P＜0.001)，Sr呈时间依赖性地促进Runx2mRNA表达，在第7天时Runx2mRNA表达达到高峰，与其余各组比较有显著统计学差异(P＜0.01);在应用1mMSr处理rBMSCs前2小时，给予10μmol/LSB431542预处理，共培养7天。单因素方差分析可知总体均数间有显著统计学差异(F=5510.983，P＜0.001)，1mMSr可明显的促进Runx2mRNA表达，与对照组相比(P＜0.01)，加入阻断剂后可明显地抑制Sr对Runx2mRNA表达的上调作用，两组比较有显著统计学差异(P＜0.01)，对照组、SB组、DMSO组三组间无统计学差异(P＞0.05)。
　　 结论
　　 1、应用全骨髓贴壁法分离、提纯、培养rBMSCs较其它方法安全、方便;rBMSCs在应用成骨诱导液培养条件下，可向成骨细胞分化，具有成骨分化的潜能。
　　 2、Sr可较好的诱导rBMSCs分化为成骨细胞，此作用可能与其上调TGF-β1-Runx2表达有关。

目录

摘要

前言

第一章 材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

第二章 结果

(一)大鼠骨髓间充质干细胞的形态学观察

(二)雷奈酸锶增加大鼠骨髓间充质干细胞的ALP活性

(三)雷奈酸锶促进大鼠骨髓间充质干细胞钙结节形成

(四)雷奈酸锶对大鼠骨髓间充质干细胞的TGF-β1表达的影响

(五)TGF-β1抑制剂拮抗雷奈酸锶对TGF-β1表达的上调作用

(六)TGF-β1抑制剂拮抗雷奈酸锶对ALP活性的促进作用

(七)TGF-β1抑制剂阻断雷奈酸锶对钙结节形成的促进作用

(八)雷奈酸锶对大鼠骨髓间充质干细胞Runx2 mRNA表达的影响

第三章 讨论

1、大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养

2、大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化

3、雷奈酸锶和骨质疏松

4、锶促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

5、TGF-β1具有促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用

6、TGF-β1促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化的可能信号传导机制

7、锶可通过TGF-β1促进大鼠骨髓问充质干细胞向成骨细胞的转化

全文总结

参考文献

中英文缩略词表

致谢

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