塞来昔布联合替莫唑胺对神经胶质细胞瘤U251细胞作用及机制研究

摘要

目的:
　　 本研究旨在检测环氧化物酶-2(COX-2)在神经胶质细胞瘤U251细胞中的表达;观察塞来昔布和替莫唑胺联合作用于神经胶质细胞瘤U251细胞时的体外抗瘤效应;探讨其可能的相关机制，旨在为进一步开展以COX-2为靶点的神经胶质瘤靶向治疗提供实验依据。
　　 方法:
　　 1、检测神经胶质细胞瘤U251细胞中COX-2的表达
　　 体外培养神经胶质细胞瘤U251细胞，在相应的条件下培养一定的时间后，分别采用免疫组织化学染色法和Western Blot法检测COX-2在神经胶质细胞瘤U251细胞中的表达。
　　 2、塞来昔布联合替莫唑胺对神经胶质细胞瘤U251细胞的体外抗瘤效应研究
　　 (1)根据干预因素不同，实验分组分为四组，分别为:
　　 ①空白对照组（不加任何药物干预）;
　　 ②单用塞来昔布组（仅仅使用塞来昔布）;
　　 ③单用替莫唑胺组（仅仅使用替莫唑胺）;
　　 ④联合用药组（联合应用塞来昔布和替莫唑胺）。
　　 (2)体外培养神经胶质细胞瘤U251细胞，培养至80％细胞密度时，按照上述分组给予药物干预，作用72小时，分别从一下几个方面进行检测:
　　 ①在倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化;
　　 ②采用MTT比色法检测各组细胞增殖情况变化;
　　 ③以Annexin V-FITC/PI双染法在流式细胞仪上检测各组细胞早期及晚期凋亡率变化;
　　 ④采用Hoechst33258染色的方法在荧光显微镜下观察各组细胞细胞凋亡形态学变化。
　　 (3)体外培养神经胶质细胞瘤U251细胞，培养至80％细胞密度时，制作划痕实验模型，按照上述分组给予药物干预，继续培养细胞24小时后在倒置相差显微镜下观察各组细胞迁移能力变化。
　　 3、塞来昔布联合替莫唑胺对神经胶质细胞瘤U251细胞作用的可能机制研究
　　 体外培养神经胶质细胞瘤U251细胞，培养至80％细胞密度时，根据上述分组给予药物干预，药物作用72小时后，以Western Blot法检测各组细胞中Bax和Bcl-2的表达。
　　 结果:
　　 1、神经胶质细胞瘤U251细胞中COX-2的表达
　　 (1)免疫组织化学染色法检测神经胶质细胞瘤U251细胞中COX-2的表达:COX-2一般存在于细胞质和细胞核，在免疫组织化学的玻片中神经胶质细胞瘤U251细胞的胞浆和胞核中均可见明显的棕黄色颗粒，COX-2蛋白在神经胶质细胞瘤U251细胞中呈现高表达状态。
　　 (2) Western Bolt法检测神经胶质细胞瘤U251细胞中COX-2表达:通过Western Blot的方法我们发现，COX-2蛋白在神经胶质细胞瘤U251细胞中呈现高表达状态。
　　 2、塞来昔布联合替莫唑胺对神经胶质细胞瘤U251细胞的体外抗瘤效应研究
　　 (1)在倒置相差显微镜下观察药物干预后神经胶质细胞瘤U251细胞形态学变化:空白对照组细胞数目较多，细胞生长状态良好，细胞贴壁生长，形态呈长梭形，细胞透亮度较大，折光性较好，增殖较快。单用替莫唑胺组和塞来昔布组的细胞体积较空白对照组缩小、变圆，透亮度减小，折光性减弱，细胞间连接减少，其中以替莫唑胺组显著，联合用药组细胞体积缩小、折光性减弱更加显著，细胞周围出现了点片状碎片，大量细胞崩解、漂浮，培养液明显变得浑浊。
　　 (2) MTT比色法检测药物干预后神经胶质细胞瘤U251细胞增殖速度变化:通过MTT比色法我们发现:空白对照组OD值为:0.79±0.03，塞来昔布组OD值0.68±0.03，替莫唑胺组OD值0.61±0.04，联合用药组OD值0.45±0.13;与空白对照组相比较，其他各药物干预组OD值均明显降低(P＜0.01)，增殖速度下降，而与塞来昔布组、替莫唑胺组比较，联合用药组OD值也显著下降(P＜0.01)增殖速度显著下降。
　　 (3) Annexin V-FITC/PI双染法检测药物干预后神经胶质细胞瘤U251细胞凋亡率变化:对照组、塞来昔布组、替莫唑胺组、联合用药组各组细胞培养72小时，流式细胞仪检测细胞凋亡率分别为4.20％±0.33％、19.12％±0.91％、24.76％±0.87％、42.98％±0.56％。与对照组相比，各干预组细胞的凋亡率显著增加(P＜0.01)，而联合用药组细胞的凋亡率比明显高于塞来昔布组和替莫唑胺组(P＜0.01)。同时我们分别比较了药物作用后，U251细胞早期凋亡率和晚期凋亡或坏死细胞率，与对照组相比，各药物干预组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡或坏死细胞率凋亡率也明显增加(P＜0.01），与塞来昔布组和替莫唑胺组相比较，联合用药组细胞早期凋亡率和晚期凋亡或坏死细胞率均明显增高(P＜0.01)。
　　 (4)采用Hoechst33258染色法在荧光显微镜下观察药物干预后神经胶质细胞瘤U251细胞凋亡形态学变化:各组细胞经DNA荧光染料Hoechst33258染色后，在荧光显微镜下观察细胞核形态变化。结果显示，正常细胞核内DNA分布相对均匀，核无固缩，在视野中呈现体积较大的浅染核形态，而凋亡细胞核内DNA浓聚，核出现不同程度的固缩，在视野中呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染的深染核形态，有细胞凋亡的典型特征。空白对照组细胞很少有凋亡;塞来昔布组和替莫唑胺组细胞凋亡数量明显增多;联合用药组细胞凋亡更加显著。
　　 (5)划痕实验观察药物干预后神经胶质细胞瘤U251细胞迁移能力变化:倒置相差显微镜下观察划痕处的细胞生长情况并拍照，通过对比同一空间位置不同时间拍下的照片得到细胞迁移的数据，以划痕宽度变化表示细胞迁移能力的大小，划痕宽度变化愈大，则表示细胞迁移能力愈强。结果显示，各组细胞培养24小时后，与空白对照组相比，各药物干预组细胞迁移能力明显减弱;与塞来昔布组和替莫唑胺组比较，联合用药组细胞迁移能力减弱更加明显。
　　 3、塞来昔布联合替莫唑胺对神经胶质细胞瘤U251细胞作用可能机制的研究
　　 Western Blot法检测药物干预后神经胶质细胞瘤U251细胞中Bax和Bcl-2的表达情况:以A值（标本灰度值/内参灰度值）表示蛋白表达水平，通过WesternBlot法检测发现:Bax在空白对照组、塞来昔布组、替莫唑胺组、联合用药组中的A值分别为0.88±0.45、0.96±0.43、1.17±0.39、1.54±0.47，与对照组比较，塞来昔布组Bax的表达水平增高(P＜0.05)，替莫唑胺组和联合用药组Bax的表达水平明显高于对照组(P＜0.01)，联合用药组Bax的表达水平显著高于塞来昔布组和替莫唑胺组(P＜0.01); Bcl-2在空白对照组、塞来昔布组、替莫唑胺组、联合用药组中的A值分别为:0.55±0.0.47、0.47±0.31、0.43±0.22、0.37±0.0.22，塞来昔布组、替莫唑胺组及联合用药组Bcl-2的表达水平明显低于对照组(P＜0.01)，联合用药组Bcl-2的表达水平低于塞来昔布组(P＜0.01)，也显著低于替莫唑胺组(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1、COX-2在神经胶质细胞瘤U251细胞中呈现出高表达状态;
　　 2、塞来昔布联合替莫唑胺作用神经胶质细胞瘤U251细胞时，使U251细胞呈现凋亡形态学变化，并可以抑制细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡;
　　 3、塞来昔布联合替莫唑胺促进神经胶质细胞瘤U251细胞凋亡的机制可能是通过上调Bax的表达同时下调Bcl-2的表达来实现的。

目录

摘要

引言

材料与方法

材料

试剂配制

实验方法

结果

第一部分:COX-2在神经胶质细胞瘤U251细胞中的表达

第二部分:塞来昔布联合替莫唑胺对神经胶质瘤U251细胞体外抗瘤效应的研究

第三部分、塞来昔布联合替莫唑胺对人神经胶质瘤U251细胞作用的可能机制研究

结论

讨论

参考文献

综述

论文统计学证明

英文缩写词

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